青霉素鈉對萼花臂尾輪蟲適合度的促進作用及其與藻密度的關系

張丙行,朱 韓,江 姍,黃克強,潘 玲,席貽龍

安徽師范大學生態與環境學院,皖江流域退化生態系統的恢復與重建省部共建協同創新中心, 蕪湖 241000

抗生素的發現被認為是20世紀最重要的科學進步之一。60余年來,抗生素被廣泛應用于人和動物疾病的防治,并作為生長促進劑被應用于畜牧業和水產養殖業[1]。抗生素在造福人類的同時,也對環境造成了污染[1- 5]。抗生素在殺滅靶向生物病原菌的同時,也造成了部分病原菌抗性的形成[6],并對部分非靶向生物產生毒性作用[1, 7- 9]。

輪蟲(Rotifer)是各類水體中廣泛分布的一類浮游動物,是抗生素作用的非靶向生物。由于其世代時間短、個體小、易于培養、繁殖速度快、對常見的水體污染物較敏感,在水生態系統的物質循環和能量流動過程中具有重要的作用,自上個世紀70年代起就被廣泛應用于水生態毒理學研究[10-11]。迄今為止,以輪蟲為受試生物研究抗生素的慢性毒性作用已有一些報道。就輪蟲種群增長率而言,抗生素的毒性作用總體上呈現出以下三種格局：(1)12.5 mg/L的氯霉素、250和500 mg/L的鹽酸氟哌酸均顯著促進褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis)的種群增長,而濃度高于50 mg/L的氯霉素和750 mg/L的鹽酸氟哌酸均起顯著的抑制作用[12]。6.25 mg/L的氯霉素和紅霉素[13]、180—200 μg/L的氟西汀(Fluoxetine)[14]和30—90 mg/L的鹽酸土霉素[15]等均顯著促進萼花臂尾輪蟲的種群增長,而濃度高于12.5 mg/L的氯霉素和紅霉素[13]、濃度高于230 μg/L的氟西汀(Fluoxetine)[14]和180 mg/L的鹽酸土霉素[15]等均起顯著的抑制作用。(2)在2.0—10.0 mg/L的測試濃度范圍內,利福平(Rifampicin)顯著地促進萼花臂尾輪蟲的種群增長[16]。(3)在5.6—2000 mg/L的測試濃度范圍內,僅2000 mg/L的硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate)、鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride)和酒石酸泰樂霉素(tylosin tartrate)顯著抑制萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲的種群增長[17]；在50—200 μg/L的測試濃度范圍內,各濃度的阿莫西林(amoxicillin)顯著抑制萼花臂尾輪蟲和哈瓦那臂尾輪蟲(B.havanaensis)的種群增長[18]。不同作用格局的呈現,究竟是由于測試的抗生素濃度范圍造成的,還是由抗生素的種類決定的？

作為水生態系統中重要的初級生產者,藻類在水體中可加速污染物降解,降低其對浮游動物的毒性；升高的藻類密度可提高輪蟲等浮游動物對污染物的耐受能力[19]。因此,有關污染物濃度和食物密度對輪蟲存活、生殖和種群增長的交互作用研究持續受到國內外學者的關注[20- 26]。然而,近年來,已有的研究所揭示出的有關抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的影響與食物密度之間的關系并不一致[15-16,26]。如亞致死濃度的利福平對萼花臂尾輪蟲生命期望、凈生殖率和種群內稟增長率的促進作用幅度隨著藻密度由1.0×106個細胞/mL升高至4.0×106個細胞/mL而逐漸顯著地增大[16],但亞致死濃度的鹽酸土霉素對萼花臂尾輪蟲生命期望、凈生殖率和種群內稟增長率的促進作用幅度在2.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度下顯著高于1.0×106和4.0×106個細胞/mL的斜生柵藻密度下[15]。其他亞致死濃度的抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的影響與食物密度之間的關系如何仍需研究。

青霉素鈉(penicillin sodium salt),又名芐基青霉素鈉鹽、青霉素G鈉鹽、芐青霉素鈉、6-苯乙酰胺基青霉烷酸,是由青霉素G(芐青霉素)和鈉結合形成的鹽。它對革蘭氏陽性細菌等致病微生物有較好的殺菌效果,具有抗菌作用強、療效高及毒性低等優點,故至今仍被廣泛應用。然而,作為一種新興污染物[1- 3],其對輪蟲的慢性毒性作用格局是什么？慢性毒性作用的強度與食物密度之間的關系如何？所有這些尚無從知曉。為此,本文以萼花臂尾輪蟲為受試生物,采用生命表試驗方法,研究了不同濃度的青霉素鈉在3個食物密度下對萼花臂尾輪蟲生命表統計學參數的影響,旨在揭示青霉素類抗生素對輪蟲實驗種群動態的影響,并為青霉素類污染物的生物監測提供適宜的指標。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源和預培養

受試生物萼花臂尾輪蟲采于蕪湖市鏡湖,在實驗室內進行克隆培養。所用培養液為EPA,由96mg NaHCO3、60mg CaSO4、60mg MgSO4和4mg KCl溶解于1L 蒸餾水中配制而成[27]；所用餌料為經HB- 4培養基[28]培養的、處于指數增長期的斜生柵藻,離心濃縮并經顯微計數后使用。實驗前,將輪蟲置于(25±1)℃、自然光照(光照強度約1300 lx,L∶D 約12∶12)的恒溫培養箱內進行為期1周的預培養。期間,每天投喂密度分別為1.0×106、2.0×106和4.0×106個細胞/mL的斜生柵藻并更換輪蟲培養液一次,同時通過去除一部分個體使輪蟲種群始終處于指數增長期。

1.2 測試液的配置

實驗所用的青霉素鈉購于Sigma公司,分析純(純度≥98%)。測試液通過母液稀釋法配置。實驗前用蒸餾水配置0.1g/L的原液,再用蒸餾水稀釋成10mg/L的母液,放置于4℃冰箱中保存以供實驗使用。實驗時用EPA將其配置成所需濃度梯度的測試液。

1.3 慢性毒性試驗

鑒于水環境中青霉素鈉的濃度僅為80—125 ng/L[29],不會對輪蟲產生顯著的毒性效應[1,4-5],因此實驗時參照阿莫西林影響萼花臂尾輪蟲生命表統計學參數的LOEC值[18],將青霉素鈉濃度設置為200、400、600、800和1000 μg/L,另設置1個空白對照組；斜生柵藻密度設置為1.0×106(較低)、2.0×106(中等)和4.0×106個細胞/mL(較高)。每個藻密度下、每個青霉素鈉濃度組設置3個重復,實驗共計45個重復(5個青霉素鈉濃度×3個食物密度×3個重復)。實驗時,分別從預培養一周后的各組輪蟲中隨機吸取齡長在4h內的輪蟲幼體,放入8 mL玻璃杯中作為受試母體,并加入5 mL測試液(其中分別含有相應濃度的青霉素鈉和相應密度的斜生柵藻),每個玻璃杯中放置10只輪蟲幼體。實驗在(25±1)℃、自然光照的恒溫培養箱中進行。實驗過程中,每間隔12 h觀察1次并記錄母體的存活數和孵化出的幼體數,移去死亡母體,并將新生的幼體移至另一玻璃杯中繼續培養,待其產卵后確定雌體類型,用于計算輪蟲一生所產全部后代中混交雌體所占的比例；每間隔24 h更換1次含有相應密度的斜生柵藻的測試液。實驗進行至輪蟲母體全部死亡為止。

1.4 研究參數的定義與計算方法

特定年齡存活率(lx)：X年齡組開始時存活個體所占的比例。

特定年齡繁殖率(mx)：X年齡組平均每個個體所產的雌性后代數。

生命期望值(e0)：每個個體出生時能活多久的估計值。

凈生殖率(R0)：種群經過一個世代后的凈增長率,R0=∑lxmx。

世代時間(T)：完成一個世代所需要的時間,T=∑lxmxx/R0。

后代混交率：所有雌性后代中混交雌體所占的比例。

1.5 數據統計和分析

采用SPSS 19.0分析軟件對數據進行分析。對所得數據作正態性檢驗后,對符合正態分布的各組數據通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗)分析各青霉素鈉濃度處理組與空白對照組間的差異顯著性,通過雙因素方差分析檢測青霉素鈉濃度、斜生柵藻密度及其交互作用對輪蟲各生命表統計學參數的影響；運用生存分析中的Log-Rank分析各藻密度下各青霉素鈉濃度處理組輪蟲存活率與對照組之間的差異顯著性；對輪蟲各生命表統計學參數與青霉素鈉濃度之間的關系進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同藻密度下青霉素鈉濃度對輪蟲存活率和繁殖率的影響

各食物密度下,對照組和5個青霉素鈉濃度處理組中萼花臂尾輪蟲的特定年齡存活率和特定年齡繁殖率如圖1所示。各藻密度下,各青霉素鈉濃度對萼花臂尾輪蟲的存活率均無顯著性影響(P> 0.05)。當藻密度為1.0×106個細胞/mL時,輪蟲的繁殖率峰值在200 μg/L的青霉素鈉溶液中最高,為5.27個后代 (雌體)-1(12h)-1；當藻密度為2.0×106個細胞/mL時,輪蟲的繁殖率峰值在800 μg/L的青霉素鈉溶液中最高,為4.67個后代 (雌體)-1(12h)-1；當藻密度為4.0×106個細胞/mL時,輪蟲的繁殖率峰值在1000 μg/L的青霉素鈉溶液中最高,為4.42個后代 (雌體)-1(12h)-1。

圖1 不同食物密度和青霉素鈉濃度下萼花臂尾輪蟲的存活率和繁殖率Fig.1 The age-specific survivorship (filled square) and fecundity curves (open square) of B. calyciflorus exposed to five concentrations of penicillin sodium and three S. obliquus densities

2.2 不同藻密度下青霉素鈉濃度對輪蟲各生命表統計學參數的影響

當藻密度為1.0×106個細胞/mL時,青霉素鈉濃度對萼花臂尾輪蟲的生命期望、世代時間和凈生殖率均具有顯著影響(P<0.05)。與對照組相比,400 μg/L青霉素鈉處理組中輪蟲的生命期望顯著延長,200和400 μg/L青霉素鈉處理組中輪蟲的世代時間顯著延長(P<0.05),200—600和1000 μg/L青霉素鈉處理組中輪蟲的凈生殖率顯著提高(P<0.05)(表1)。

當藻密度為2.0×106個細胞/mL時,青霉素鈉濃度對輪蟲的生命期望、世代時間、凈生殖率和內稟增長率均具有顯著影響(P<0.05)。與對照組相比,200—1000 μg/L青霉素鈉處理組中輪蟲的生命期望和世代時間顯著延長(P<0.05),凈生殖率和內稟增長率顯著升高(P<0.01)(表1)。

當藻密度為4.0×106個細胞/mL時,青霉素鈉濃度對輪蟲的所有生命表統計學參數均無顯著性影響(P>0.05)(表1)。

表1 不同食物密度和青霉素鈉濃度下萼花臂尾輪蟲生命表統計學參數(均數±標準誤)

雙因素方差分析結果表明,食物密度對輪蟲的生命期望、凈生殖率、內稟增長率和后代混交率均具有顯著性影響(P<0.05),青霉素鈉濃度對輪蟲的世代時間、凈生殖率和內稟增長率有顯著性影響(P<0.05),食物密度和青霉素鈉濃度的交互作用對輪蟲的生命期望、凈生殖率和內稟增長率具有顯著性影響(P<0.05)。

2.3 不同食物密度下輪蟲生命表統計學參數與青霉素鈉濃度間的關系

回歸分析結果表明,當食物密度為1.0×106個細胞/mL時,青霉素鈉濃度與輪蟲的生命期望、世代時間和凈生殖率間均具有顯著的劑量—效應關系；當食物密度為2.0×106個細胞/mL時,青霉素鈉濃度與輪蟲的生命期望、世代時間和內稟增長率間均具有顯著的劑量—效應關系(表3)。

表2 食物密度和青霉素鈉濃度對萼花臂尾輪蟲生命表統計參數的影響(雙因素方差分析)

表3 不同食物密度下萼花臂尾輪蟲的生命表統計學參數與青霉素鈉濃度(μg/L)間的關系

3 討論

3.1 輪蟲存活、生殖和種群增長對抗生素污染的響應格局

自然水體中,抗生素的濃度通常在ng/L—μg/L,因此環境相關濃度的抗生素對輪蟲的存活、生殖和種群增長等無顯著性影響[1,4-5]。然而,亞致死濃度的抗生素卻對其具有顯著性影響[15-18,30],本研究結果亦然。從已報道的研究結果來看,在亞致死濃度范圍內,一定濃度范圍內的抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的影響總體上呈現出“抑制”、“促進”和“低促高抑”等三種格局。首先,一定濃度的硫酸鏈霉素、鹽酸四環素、酒石酸泰樂霉素[17]和阿莫西林[18]對萼花臂尾輪蟲、哈瓦那臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲等的存活、生殖和種群增長具有抑制作用,且最低可觀察效應濃度(LOEC)與抗生素和輪蟲的種類有關。其次,一定濃度范圍內的利福平[16]、諾氟沙星[30]和青霉素鈉(本研究)對萼花臂尾輪蟲的存活、生殖和種群增長具有促進作用。再次,一定濃度的鹽酸土霉素[15]對輪蟲存活、生殖和種群增長的影響具有“低促高抑”特點(表4)。鑒于較低濃度(低于Araujo和McNair[17]所設計的最低測試濃度5.6 mg/L)的利福平[16]、諾氟沙星[30]和青霉素鈉(本研究)對萼花臂尾輪蟲的存活、生殖和種群增長所具有的促進作用,以及較高濃度的硫酸鏈霉素、鹽酸四環素、酒石酸泰樂霉素[17]、阿莫西林[18]和鹽酸土霉素[15]等抗生素對輪蟲的存活、生殖和種群增長所具有的抑制作用,我們推測 “低促高抑”可能是抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長影響的主要格局。當然,這一推測仍需要通過對更多種類的抗生素在更寬的測試濃度和食物密度范圍內進行研究加以證實。

表4 抗生素促進或抑制輪蟲存活、生殖和種群增長的最低可觀察效應濃度/(mg/L)

3.2 抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的影響與食物密度之間的關系

已有研究結果表明,與較低和較高的藻密度相比,中等的藻密度可降低污染物對輪蟲存活、生殖和種群增長的抑制作用[20- 25]。Jiang等[15]的研究結果表明,中等的斜生柵藻密度(2.0×106個細胞/mL)不僅降低了較高濃度的鹽酸土霉素對萼花臂尾輪蟲存活、生殖和種群增長的抑制作用幅度,而且提高了較低濃度的鹽酸土霉素對萼花臂尾輪蟲存活、生殖和種群增長的促進作用幅度。本研究中,中等的斜生柵藻密度也提高了較低濃度的青霉素鈉對萼花臂尾輪蟲存活、生殖和種群增長的促進作用幅度。翟盼等[16]研究發現較低濃度的利福平對萼花臂尾輪蟲生命期望、凈生殖率和種群內稟增長率的促進作用幅度隨著藻密度由1.0×106個細胞/mL升高至4.0×106個細胞/mL而逐漸顯著地增大；這一結果與上述結果的不一致是否可歸因于藻類的生長狀況,還有待于進一步的研究。

3.3 抗生素影響輪蟲存活、生殖和種群增長的可能機制

有關抗生素影響輪蟲存活、生殖和種群增長的機制,目前尚不明確。就較高濃度的抗生素的抑制作用而言,多數學者將其歸結為抗生素的毒性作用[12-13,15,17-18,26]。Wollenberger等[7]在研究鹽酸土霉素等抗生素對大型溞(Daphniamagna)存活和生殖的影響時認為,較高濃度的抗生素通過對藻類的毒性作用從而間接地對枝角類的存活和生殖起抑制作用。但是,與中等的藻密度相比,藻類密度的升高和降低均增強了較高濃度的鹽酸土霉素對萼花臂尾輪蟲存活、生殖和種群增長的抑制作用幅度[15],提示較高濃度的抗生素的抑制作用可能主要源于其毒性作用。

就較低濃度的抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的促進作用而言,三個主要的機制先后被提出。首先,利福平和鹽酸土霉素等抗生素通過有效殺滅輪蟲體內和喂食的藻類中可能存在的一些有害細菌,從而促進了輪蟲的存活、生殖和種群增長[15-16]。其次,鑒于利福平和布洛芬等可能具有的環境雌激素效應[16,25],而一部分已被證明具有環境雌激素效應的低濃度污染物如Cd2+[22]、Zn2+[24]、艾氏劑[31]、狄氏劑[32]和十氯丹[33]等可促進輪蟲存活、生殖和種群增長,因此較低濃度的利福平等抗生素的促進作用被部分歸因于其雌激素效應[16]。再次,由于鹽酸四環素[26]等抗生素具有和Hg2+[34]等污染物相似的“低促高抑”作用,毒物興奮效應(hormesis)[35]被用于解釋較低濃度的抗生素對輪蟲存活、生殖和種群增長的促進作用[26]。包括青霉素鈉等在內的較低濃度的抗生素究竟是通過哪個或那幾個機制促進輪蟲存活、生殖和種群增長,仍需進一步研究。

3.4 輪蟲有性生殖與抗生素種類和濃度以及食物密度之間的關系

單巢綱輪蟲具有典型的周期性孤雌生殖的繁殖方式。通常情況下,單巢綱輪蟲主要以孤雌生殖的方式繁殖；但在特定的條件下,如較低的食物質量和較高的種群密度,單巢綱輪蟲進行有性生殖,產生休眠卵,以適應不利的環境條件。已有研究表明,在1.0×106、2.0×106和4.0×106個/mL的斜生柵藻密度下,2.0—10.0 mg/L的利福平均顯著提高萼花臂尾輪蟲的后代混交率,其中1.0×106和4.0×106個/mL的斜生柵藻密度下后代混交率提高幅度較大[16]。在1.0×106、2.0×106和4.0×106個/mL的斜生柵藻密度下,13.5— 40.5 mg/L、40.5 mg/L和40.5 mg/L的鹽酸四環素顯著地提高萼花臂尾輪蟲的后代混交率,其中1.0×106和4.0×106個/mL的斜生柵藻密度下后代混交率提高幅度也較大[26]。與上述研究結果不同的是,三個斜生柵藻密度下,鹽酸土霉素濃度對萼花臂尾輪蟲的后代混交率卻無顯著性影響[15]。與Jiang等[15]的研究結果相一致,本研究結果表明,各食物密度下,青霉素鈉濃度對萼花臂尾輪蟲的后代混交率也無顯著性影響。看來,輪蟲有性生殖的發生幅度與抗生素的種類和濃度等有關。

3.5 輪蟲各生命表統計學參數對抗生素污染的敏感性

綜合現有的研究結果來看,萼花臂尾輪蟲各生命表統計學參數對抗生素污染的敏感性因抗生素種類和食物密度的不同而存在著差異。在1.0×106、2.0×106和4.0×106個細胞/mL等三個斜生柵藻密度下,生命期望和后代混交率對利福平污染均具有較高的敏感性[16],凈生殖率對鹽酸土霉素污染具有較高的敏感性[15]。在1.0×106和2.0×106個細胞/mL等兩個斜生柵藻密度下,世代時間對鹽酸四環素具有較高的敏感性[26]；與此相似的是,本研究結果表明,在1.0×106和2.0×106個細胞/mL等兩個斜生柵藻密度下,世代時間和凈生殖率對青霉素鈉均具有較高的敏感性。