丹皮酚通過調節中腦星形細胞神經營養因子的表達及細胞質/核易位抑制類風濕關節炎成纖維滑膜細胞炎癥反應

邵玉寶，鮑蘭馨，汪陶榮，李文昊，周文瀚，戴錦辰，陳萌檬，葉 靜，趙大海，陳曉宇,

(安徽醫科大學基礎醫學院1.組織胚胎學教研室、2.病理學與病理生理學、3.形態學實驗中心、4.臨床醫學系，安徽 合肥 230032；5.安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，安徽 合肥 230601)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性的免疫疾病，通常表現為手腳關節腫脹和疼痛，周圍血管和神經也可能會參與其中[1]。在RA關節中經常觀察到的先天性和適應性免疫反應的慢性激活以及相關的缺氧和低血糖水平，對內質網(ER)造成了相當大的負擔，最終可能導致未折疊蛋白反應(UPR)與內質網相關蛋白降解(ERAD)一起被激活[2]。UPR會促進ER膜上蛋白活化轉錄因子(activating transcription factor 6，ATF6)發生剪切，進一步激活PI3K-AKT-NF-κB通路，促進炎癥的進一步發生；同時激活PERK的磷酸化，激活下游eIF2α磷酸化，最終促進NF-κB的活化[3]。中腦膠質細胞神經營養因子(mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor，MANF)與BIP78以鈣依賴形式相互作用定位在內質網膜。當炎癥發生時，引發內質網應激，內質網中Ca2+釋放入胞質，MANF分泌。MANF可減輕多種由ER應激所引起的損傷，如減小肝損傷，促進神經再生，角膜修復，抑制骨關節炎等[4-5]。研究表明，MANF能夠抑制膠原誘導的兔關節炎的發展[4]。在肝癌細胞中，MANF在SUMO蛋白的作用下向細胞核轉移，與核因子p65(nuclear factor kappa-B p65，p65)結合并抑制其轉錄活性[5]。

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的干燥根皮中提取物出來的一種有效成分，具有廣泛的抗炎活性[6]。丹皮酚具有良好的對抗ER應激效果，可以改善衣霉素損傷的小鼠主動脈的內皮依賴性舒張，通過5'腺苷單磷酸激活的蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活的受體δ激活，進一步降低ER應激水平及GRP78、ATF6、eIF2α蛋白表達及ROS的過量生產并提高NO的生物利用度[7-9]。

目前，丹皮酚與MANF的關系尚不明確，丹皮酚是否會影響MANF的表達，是否會影響MANF細胞質/核易位。本文主要研究丹皮酚通過對MANF蛋白表達水平及細胞質/核易位的調控對RA成纖維滑膜細胞炎癥反應影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 人類風濕關節炎成纖維滑膜細胞(RA-FLSs)購買于上海冠導生物工程有限公司。TRIzol(15596026)，購買于InvitrogenTM；NEAA(PB180424)、ITS-A(PB180430)、NaP(PB180422)及胎牛血清(164210)購買于普諾賽生命科技；DMEM培養基(SH30022.01)購買于Hyclone；CCK-8(C0037)購買于碧云天生物技術；TNF-α(H8916)購買于Sigma公司；MANF(ab67271)、p65(8242T)與Actin(ab8226)購買于Abcam；N-cadherin(3195S)、Vimentin(5741S)、β-Tublin(15115S)、GAPDH(5174S)與Lamin-B(17416S)購買于Cell Signaling Technology；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)購買于Takara公司；實時熒光定量試劑盒Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen(4385610)購買于ThermoFisher公司；

1.1.2儀器 激光掃描共聚焦顯微鏡LSM880(德國)；電泳儀(DYY-10，北京六一儀器廠)；Image-Pro plus 圖像處理系統；熒光定量儀PCR-ABI(賽默飛世爾科技，美國)；多功能酶標儀(PerkinElmer，美國)；GraphPad Prism 7.00數據處理軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 RA-FLSs培養在高糖DMEM培養基中，添加質量分數為1%的非必須氨基酸(NEAA)、胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS-A,1mmol·L-1)、丙酮酸鈉(NaP)及1%的胎牛血清(FBS)，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中，每2 d更換一次新鮮培養基。

1.2.2細胞增殖抑制 將對數生長期的細胞鋪在96孔板中，每孔100 μL(1 000個細胞)，使用TNF-α(10 μg·L-1)刺激12 h后，加丹皮酚處理48 h。更換新鮮培養基，每孔添加10 μL CCK-8檢測試劑，于37 ℃繼續培養2 h，酶標儀檢測460 nm處吸光度值。

1.2.3免疫印跡 取對數生長期的細胞，鋪6孔板中，待細胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理24 h，獲取細胞沉淀塊。細胞重懸在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，添加2 X SDS裂解液(100 mmol·L-1Tris-Cl(pH 6.8)、4%(W/V)SDS、20%(V/V)Glycerol、200 mmol·L-1DTT(Dithiothreitol))得蛋白溶液，其中PBS ∶2 X SDS=1 ∶1(V/V)。使用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，SDS-PAGE電泳時每個孔道加10 μg蛋白樣品，轉膜，4 ℃孵育一抗MANF、NF-κB-p65、Actin、GAPDH、β-Tublin、Lamin-B、ATF6、N-cadherin、Vimentin(1 ∶1 000)過夜；二抗于室溫孵育1 h，使用TBST洗3次，每次10 min，ECL化學發光曝光1-5 min，顯影。

1.2.4實時熒光定量PCR 取對數生長期的細胞，鋪6孔板中，待細胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理24 h，獲取細胞沉淀塊，使用TRIzol進行裂解及RNA提取。使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA(100 μg·L-1)作為模板，加入IL-6(5 μmol·L-1)和TNF-α(5 μmol·L-1)引物，使用SYBR Green預混液擴增mRNA，擴增程序設置為35個循環(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)，在熒光定量PCR儀中檢測熒光信號。以未處理組為對照，通過2^-ddCt方法進行定量分析，獲取不同處理方式中mRNA水平的表達情況。引物信息如下：IL-6，正向“5′-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTC-3′”,反向“5′-AGAGGTGAGTGGCTGTCTGTGT-3′”；TNF-α：正向“5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′”，反向“5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′”。

1.2.5細胞遷移 使用記號筆在6孔板底部畫水平橫線，取對數生長期的細胞，鋪6孔板中，待細胞鋪滿皿底面積一半時，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚濃度處理48 h。使用槍頭在6孔板中垂直畫線以確定每次觀察位置相同，PBS洗去漂浮細胞，更換新鮮培養基，于顯微鏡下拍照。將細胞放在培養箱中繼續培養12 h，選取相同的位置再次拍照，通過ImageJ統計空白處面積所占比例，以比較不同處理方式中細胞的遷移效率。

1.2.6免疫熒光 細胞爬片經消毒滅菌后置于6孔板中，將處于對數生長期的RA-FLSs鋪于細胞爬片，待細胞貼壁，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，使用丹皮酚(50 μmol·L-1)處理24 h。移除培養基，PBS洗3次，使用4%多聚甲醛進行固定10 min，30 g·L-1的BSA封閉1 h后使用p65(1 ∶50)與MANF(1 ∶100)抗體進行免疫一抗標記，4 ℃孵育12 h；熒光二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，DAPI室溫孵育10 min，洗去殘留二抗及DAPI后封片。使用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞中p65與MANF蛋白的表達量及表達位置。

1.2.7核蛋白分離 RA-FLSs經過TNF-α處理12 h后，加丹皮酚處理24 h。將收取的細胞團塊用細胞質裂解液(10 mmol·L-1HEPES、1.5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1的KCl、0.5 mmol·L-1的DTT、0.05%(V/V)的NP-40，pH 7.9)進行重懸，同時在其中加入蛋白酶體抑制劑及PMSF試劑，冰上裂解40分鐘，收取上清即為胞質蛋白。將沉淀使用細胞核裂解液(5 mmol·L-1HEPES、1.5 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1EDTA、0.5 mmol·L-1DTT、26%(V/V)甘油，pH 7.9)進行重懸，冰上裂解30 min后離心，所得上清即為細胞核蛋白。通過Western blot檢測MANF和p65的細胞質/核易位水平。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 7.0統計學軟件，并以均數±標準差(mean±SD)的形式呈現，兩組間的值的比較以t檢驗，多組間均數差異性比較以單因素方差分析(One-way ANOVA)為主，兩兩比較采用SNK-q分析。

2 結果

2.1 丹皮酚抑制滑膜細胞的異常增殖檢測RA-FLSs對丹皮酚的耐受程度，Fig 1 A所示，當丹皮酚濃度低于100 μmol·L-1時，不會影響FLSs的活性(t=2.856，P=0.4448)。使用TNF-α(10 μg·L-1)刺激FLSs細胞12 h，丹皮酚(1、10、50、100 μmol·L-1)處理細胞48 h，結果Fig 1 B所示，對處于炎癥狀態下的FLSs，丹皮酚達到50 μmol·L-1可對其異常增殖產生抑制作用(t=4.497，P=0.0394)。

2.2 丹皮酚抑制滑膜細胞的遷徙細胞遷移實驗顯示Fig 2 A，與TNF-α組相比，丹皮酚濃度為100 μmol·L-1對RA-FLS的遷徙產生抑制作用(t=8.998，P=0.001)。進一步研究了丹皮酚對細胞遷徙相關蛋白N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達的影響。如Fig 2 B所示，與對照組相比，TNF-α組N-cadherin、Vimentin蛋白水平均升高；與TNF-α組相比，丹皮酚(100 μmol·L-1)處理48 h能夠降低N-cadherin(t=22.9，P=0.001)、Vimentin(t=29.69，P=0.001)。

Fig 1 Paeonol can inhibit the abnormal proliferation of fibroblast synoviocytes induced by TNF-α

Fig 2 Paeonol can inhibit the expression of migration-related protein

2.3 丹皮酚通過ER應激增加MANF的表達使用Western blot方法檢測丹皮酚對RA-FLSs中MANF蛋白表達變化。如Fig 3所示，FLSs經過TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h，丹皮酚(1、10、100 μmol·L-1)處理24 h，與對照組相比，TNF-α組中細胞MANF表達增加(t=9.498，P<0.01)；與TNF-α組相比，1 μmol·L-1丹皮酚處理后即可觀察到MANF增加(t=19.45，P<0.01)，MANF上游蛋白ATF6變化趨勢與MANF基本保持一致。

2.4 免疫熒光觀察丹皮酚促進MANF的核位移通過免疫熒光檢測，對轉錄因子p65及MNAF蛋白的表達情況即細胞定位進行檢測。結果如Fig 4 A、B顯示，與對照組相比，TNF-α(10 μg·L-1)處理12 h后的FLSs尚不能觀察到MANF的細胞質/核易位增加。與TNF-α組相比，使用丹皮酚(50 μmol·L-1)處理24 h后，MANF細胞質/核易位水平增加(t=21.16，P<0.01)。

2.5 核蛋白檢測丹皮酚促進MANF的核位移為了對丹皮酚促進MANF細胞質/核易位的程度進行量化，通過對RA-FLSs細胞的核蛋白與胞質蛋白進行分離，分別檢測其中的p65與MANF蛋白表達。如Fig 5顯示，在細胞核中，MANF蛋白水平在丹皮酚(10 μmol·L-1)處理后升高(t=38.81，P<0.01)；與之對應，轉錄因子p65在經過TNF-α(10 μg·L-1)誘導后入核明顯，當使用丹皮酚(10 μmol·L-1)處理后，細胞核中p65水平降低(t=3.541，P<0.01)。同時可以觀察到，在胞質蛋白中，p65蛋白變化水平與細胞核內變化趨勢相反，當TNF-α刺激后，細胞質中p65水平降低，當使用丹皮酚處理后，細胞質中p65蛋白水平恢復。

2.6 丹皮酚抑制滑膜細胞的炎癥反應通過RT-qPCR檢測炎癥因子mRNA，如Fig 6 A、B所示，與TNF-α(10 μg·L-1)組相比，丹皮酚(10 μmol·L-1)能夠抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的mRNA異常轉錄(t=9.233，P<0.01;t=6.053，P<0.01)。通過在FLS細胞中穩定表達p65-promoter，研究丹皮酚對p65轉錄因子的活性抑制，結果如Fig 6 C所示，TNF-α刺激可增強p65的轉錄活性(t=38.81，P<0.01)，而丹皮酚(1、10、50、100 μmol·L-1)可以劑量依賴性降低p65的轉錄活性，且當濃度為1 μmol·L-1即有統計學意義(t=44.09，P<0.01)。

3 討論

天然產物丹皮酚具有良好的抗炎效果，在傳統中藥中已被廣泛使用，其安全性有足夠的保證[8]。在研究RA的過程中，以FLSs當作研究模型，FLSs在RA的疾病發展中起到重要作用[10]。本研究首先對丹皮酚安全性進行驗證，當丹皮酚濃度達到100 μmol·L-1時，不會對FLSs活性產生明顯的抑制作用。RA表現為RA-FLSs細胞的異常增殖及侵襲，藥物通過抑制RA-FLSs細胞異常增殖產生對RA的抑制作用[10]。鈣黏附蛋白N-cadherin和波形蛋白Vimentin在細胞侵襲和遷移過程中發揮重要作用[11-12]。研究中，丹皮酚對RA-FLSs的異常增殖及N-cadherin和Vimentin蛋白水平均產生抑制(Fig 2B)。

RA形成的原因復雜，多種細胞參與其中，如B細胞、T細胞、單核巨噬細胞、FLS細胞等[13]。而MANF是一種分泌蛋白，其表達和分泌量的增加有助于在不同種類細胞間產生其保護作用[14]。如MANF可以促進免疫細胞表型從促炎性巨噬細胞轉變為修復性抗炎性巨噬細胞[12]。MANF啟動子ERSE-Ⅱ受ATF6所調控，其分泌與內質網應激水平密切相關[15-16]。MANF上游ER應激相關蛋白ATF6表達在丹皮酚作用下維持在較高水平(Fig 3)。當RA-FLSs細胞中MANF表達量增高，又可以進一步對周圍其他參與RA進展的炎癥細胞產生抑制作用，與藥物形成協同，預期可以產生更好的炎癥抑制效果。與直接使用MANF純化蛋白進行相比，丹皮酚使用成本更低。

Fig 3 Paeonol promoted MANF expression

Fig 4 Paeonol increased level of protein MANF in nucleus

中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)首次發現是作為一種星形膠質細胞條件培養基中的一種新的多巴胺能神經營養因子[17]。最近的研究表明，MANF可以在SUMO的介導下，由細胞質轉移到細胞核中，通過與轉錄因子p65結合并抑制其轉錄活性而產生炎癥抑制作用[10]。通過免疫熒光及核、漿蛋白分離實驗，證明丹皮酚能夠促進MANF細胞質/核易位(Fig 4、5)。在抑制p65轉錄活性這條通路上，增加MANF細胞質/核易位水平，將大大提高其炎癥抑制能力。轉錄因子p65在活性狀態下能夠激活包括IL-6、IL-1β、TNF-α等多種炎癥因子的表達[18]。通過克隆p65啟動子，將其外源表達在RA-FLSs細胞中。結果顯示p65的轉錄活性劑量依賴性的受到丹皮酚影響(Fig 6)。總之，丹皮酚能夠有效的增加MANF蛋白的表達，并且促進MANF蛋白的核轉移，從而抑制轉錄因子p65的活性，發揮其抑制炎癥的功能。

Fig 5 Paeonol inhibits RA-FLSs inflammatory progression by promoting nuclear transfer of MANF

Fig 6 Paeonol can produce an inflammatory effect by inhibiting the transcriptional activity of p65