內質網應激肝癌細胞通過外泌體-Toll樣受體4信號途徑促進巨噬細胞M2極化

化 維，朱嫚嫚，范璐璐，孫國平，劉加濤

(安徽醫科大學第一附屬醫院 1.藥劑科、2.腫瘤科，安徽 合肥 230022)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六常見的惡性腫瘤，占癌癥相關死因的第四位。更為棘手的是，在過去的幾十年中，肝癌的治療一直沒有突破。肝臟被認為是人體獨特的免疫器官。肝臟微環境的慢性炎癥以及由病毒感染和代謝紊亂引起的免疫細胞功能異常對肝癌的發展具有重要影響[1]。從理論上講，免疫療法可能為肝癌的治療帶來新的突破。但是，目前的免疫療法在肝癌的治療中尚未取得令人滿意的突破。因此，迫切需要一種有效的肝癌治療方法。

惡性腫瘤細胞內外的應激壓力如異常增殖、缺血、缺氧等均可能導致大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質積聚在內質網腔中，引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]。研究表明，ERS相關基因或蛋白在多種實體瘤中異常激活，而ERS的持續激活與諸如肝癌等多種腫瘤的發生、轉移、耐藥和免疫逃逸密切相關[3]。最近，我們發現內質網激活的肝癌組織可以募集大量高表達免疫抑制分子的巨噬細胞[4]。巨噬細胞可分為具有抗腫瘤活性的經典活化M1型和具有促腫瘤作用的替代活化M2型。有報道稱，內質網應激增加了肝細胞癌中GP73的分泌，GP73參與TAM表型有關的細胞因子和趨化因子的釋放[5]。這些結果表明，ERS可能與HCC微環境中巨噬細胞的募集以及M2轉化有關，但其潛在機制仍不清楚。

外泌體是直徑為30-150 nm的細胞外囊泡，幾乎所有細胞都可分泌。研究表明，腫瘤細胞可通過外泌體促使微環境中其他細胞“感知”腫瘤信號，促進免疫和炎性細胞的表型和功能的變化，從而有利于腫瘤免疫逃逸[6]。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細胞在熱應激、饑餓和缺氧等壓力下合成的一組高度保守的蛋白。HSP70是熱休克蛋白家族的重要成員，也是外泌體的表面標志之一。最近的研究表明，外源性HSP70可以與抗原呈遞細胞上的Toll樣受體4結合，并起免疫調節作用[7]。TLR4是能夠與4種Toll樣-白介素受體結構域結合的先天免疫受體，可啟動下游信號級聯，調控細胞因子和趨化因子的釋放，是先天免疫和適應性免疫的重要介質。研究表明，TLR4參與腫瘤的發生發展、轉移侵襲和化療耐藥等過程，如TLR4可刺激結腸癌中IL-6和一氧化氮的產生，促進腫瘤的發展[8]。文獻報道[9]，激活樹突狀細胞(DC)TLR4/NF-KB途徑，可以促進DC細胞的成熟和遷移。Karina等[10]發現宮頸癌細胞的培養上清液可促進M1型巨噬細胞向M2型轉化，并且上調巨噬細胞中Toll 樣受體的表達，但宮頸癌細胞上清液促進巨噬細胞極化和TLR4上調的具體機制尚不清楚。因此，我們推測內質網應激肝癌細胞分泌的外泌體可能通過上調巨噬細胞表面TLR4受體，進而促進巨噬細胞的表型轉化。

1 材料

1.1 細胞培養肝癌細胞HepG2、Hep3B和小鼠巨噬細胞RAW264.7均購于中國科學院上海細胞庫，以含10%胎牛血清(以色列BI公司)和1%的青霉素-鏈霉素(上海碧云天有限公司)的DMEM培養基(以色列BI公司)在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。肝癌細胞隔天更換培養基，直至細胞融合到80%-90%左右用胰酶(上海碧云天有限公司)消化傳代，RAW264.7細胞每天更換培養基，吹打傳代。

1.2 主要試劑及儀器衣霉素購于美國Sigma公司(貨號：T7765)；外泌體提取試劑盒(ExoQuick-TCTM)和無外泌體血清購自于美國SBI公司(貨號：EXOTC50A-1、EXO-FBS-250A-1)；兔抗GRP78抗體購自南京Bioworld有限公司(貨號：AA53131)；兔抗CD63、兔抗TSG101、兔抗Arg-1和兔抗TGF-β1購自于英國Abcam公司(貨號：ab217345、ab125011、ab60176、ab92486)；兔抗Calnexin、兔抗HSP70、鼠抗β-actin、鼠抗GAPDH購自于美國Cell Signaling Technology公司(貨號：#2679、#4873、#3700、#5174，)；DAPI染核液購自于美國Sigma公司；小鼠炎癥因子CBA試劑盒購自于美國BD Biosciences公司(貨號：5008944)；抗鼠FITC-F4/80、抗鼠PE-CD206和抗鼠TLR4購自于美國BioLegend公司(貨號：#123115、Clone C068C2、#145403)；PKH67 熒光細胞膜標記試劑盒購自于美國Sigma公司(貨號：SLBM4309V)；Image Quant LAS 4000發光成像系統購自美國GE公司；FC500流式細胞儀購自美國Beckman coulter公司；M450酶標儀購自美國BioRad公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

2 方法

2.1 蛋白印跡實驗取對數生長期的人肝癌細胞系或RAW264.7細胞，接種到六孔板中，培養貼壁12h以后，根據各試驗目的分別處理。收集各處理組的細胞，PBS清洗3遍，加入適量含1% PMSF(蛋白酶抑制劑)的蛋白裂解液冰上裂解30 min，以12 000 r·min-1離心10 min，取蛋白上清，加入5× Loading buffer混勻，沸水中煮10-15 min，再用BCA試劑盒進行蛋白定量。向聚丙烯酸凝膠中加入20-30 μg每孔的樣品，經過電泳、轉膜等步驟將蛋白轉至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別與相應的一抗(如β-actin抗體、GRP78抗體、HSP70抗體、CD63抗體、Arg-1抗體、TGF-β1抗體、TSG101抗體和Calnexin抗體，稀釋比例均為1 ∶1 000)孵育過夜。TBST洗膜3遍，二抗室溫敷育1 h后TBST洗膜3次，Image Quant LAS 4000發光成像系統顯影。

2.2 外泌體的提取分別收集TM誘導內質網應激前后HepG2細胞和Hep3B細胞的培養上清，3 000 r·min-1離心15 min去除細胞碎片。使用外泌體提取試劑盒(ExoQuick-TCTM)分離正常培養肝癌細胞上清中的外泌體(Exo-con)和內質網應激肝癌細胞培養上清中的外泌體(Exo-TM)，并通過透射電鏡和蛋白印跡試驗対收集的外泌體進行鑒定。

2.3 電鏡將純化的外泌體從冰箱中取出并在冰上自然融化，取10 μL純化的Exo-con和Exo-TM添加到銅網中，室溫靜置3 min，然后以2%磷鎢酸復染3 min。最后，用PBS清洗銅網，并在室溫下自然晾干，使用透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態。

2.4 免疫組化實驗所有肝癌和正常肝組織均經福爾馬林固定，石蠟包埋和去石蠟。經阻斷內源性過氧化物酶活性和抗原修復等操作之后，將切片與GRP78一抗孵育過夜。濕盒中取出切片，洗滌，與二抗共孵育。最后，用二氨基聯苯胺染色，并使用蘇木精復染，顯微鏡下觀察。通過將染色強度乘以染色細胞的百分比對GRP78的表達水平進行評分[4]。

2.5 免疫熒光檢測用PKH67標記肝癌細胞分泌的外泌體，加入RAW264.7培養皿中共培養12 h后，用0.5% Triton-100破膜10 min，用預冷的PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，再次清洗3遍后，DAPI染核5 min，PBS清洗兩遍，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.6 流式細胞術將RAW264.7細胞與Exo-con和Exo-TM(10 mg·L-1)共同孵育24 h，然后收集細胞并用預冷的PBS洗滌，離心并重懸，并加入適量Biolegend公司的抗鼠FITC-F4/80、抗鼠PE-CD206或抗鼠PE-TLR4(貨號：123107、117605、141705)。孵育45 min后，以含有1% BSA的預冷PBS洗滌2次，重懸后流式細胞儀檢測，使用FlowJo10.5.4軟件(Tree Star，Inc.)進行分析。

2.7 細胞因子檢測使用“2.6”步所得的細胞上清液與CBA試劑盒室溫共同孵育4 h，經流式細胞儀檢測Exo-con和Exo-TM對RAW264.7細胞IL-6和IL-10表達水平的影響。

2.8 Affymetrix基因芯片篩選差異表達的mRNA和生物信息學分析通過Affymetrix基因芯片對Exo-con和Exo-TM處理后巨噬細胞免疫調節相關基因的表達譜進行分析。過程簡述如下：使用TRIzol提取Exo-con和Exo-TM處理后巨噬細胞的總RNA，使用T7 Oligo(dT)引物與第一鏈酶混合，合成cDNA第一鏈。然后，利用第二鏈酶混合物合成cDNA第二鏈和雙鏈cDNA，并使用有機溶劑提純雙鏈cDNA，再使用T7酶混合液并加入生物素體外合成cDNA。最后，對合成的RNA進行純化、定量和片段化，并將片段化的cRNA與Affymetrix芯片雜交。利用KEGG Orthology Based Annotation系統對不同mRNAs的Gene Ontology(GO)生物學過程特征和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號通路進行分析。

2.9 統計學處理采用SPSS 22.0 統計軟件處理，數據采用均數±標準差表示，兩組間的比較采用配對t檢驗，兩組以上數據比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 衣霉素誘導肝癌細胞內質網應激首先使用內質網應激誘導劑衣霉素(tunicamycin，TM)構建肝癌細胞內質網應激模型。Western blot分析表明，TM可劑量(0、1.25、2.5和5.0 μmol·L-1)依賴性增加ERS標志蛋白GRP78的表達(Fig 1A，1B)。然而，相比于2.5 μmol·L-1組，5.0 μmol·L-1濃度的TM并沒有顯著提高GRP78蛋白的表達水平(Fig 1A，1B)。隨后，我們使用2.5 μmol·L-1的TM刺激HepG2細胞不同時間(0、12、24和48 h)，發現GRP78的表達與TM刺激時間呈正相關，差異有統計學意義(P<0.01)，但24與48 h組無差異(Fig 1C，1D)。上述結果表明，2.5 μmol·L-1衣霉素作用24 h可以在HCC細胞中建立合適的ERS模型。此外，Western blot檢測4對肝癌組織和相應的非癌性肝組織標本GRP78的蛋白水平，發現腫瘤組織表達的GRP78蛋白水平更高(Fig 1E)，免疫組織化學染色進一步證實上述結果(Fig 1F)。

Fig 1 ER stress in liver cancer cells activated by tunicamycin

Fig 2 Exosomes efficiently incorporated by macrophages

3.2 巨噬細胞可有效地攝取肝癌細胞釋放的外泌體透射電子顯微鏡(TEM)顯示分離到的沉淀物呈圓形或類圓形的雙層囊泡結構，符合典型的外泌體形態學特征，并且Exo-TM組(Fig 2A)中囊泡的直徑較Exo-con組(Fig 2B)更大。Western blot實驗進一步證實，這些圓形囊泡表達跨膜蛋白CD63、TSG101和熱休克蛋白70(HSP70)外泌體標志蛋白，且不表達內質網蛋白Calnexin，表明提取的囊泡是外泌體(Fig 2C)。值得注意的是，與Exo-con相比，內質網應激肝癌細胞分泌的外泌體攜帶更多的HSP70(Fig 2C)。此外，我們使用PKH67標記外泌體，并將這些PKH67標記的外泌體與RAW264.7細胞共培養12 h，激光共聚焦顯微鏡觀察RAW264.7可以有效地攝取PKH67標記的外泌體(Fig 2D，2E)。

3.3 Exo-TM促進巨噬細胞轉化為M2表型為了探索ERS的HCC細胞能否通過傳遞外泌體影響巨噬細胞極化。FCM發現，與Exo-con相比，HepG2分泌的Exo-TM與RAW264.7細胞共培養24 h可以顯著地增加CD206的表達(Fig 3A)，差異有統計學意義(P<0.05)。Hep3B細胞來源的Exo-TM作用RAW264.7細胞也得到相似的結果(Fig 3B)。通過Western blot分析還發現，與Exo-con處理的RAW264.7細胞相比，Exo-TM處理的巨噬細胞Arg-1(P<0.05)和TGF-β1(P<0.01)蛋白水平明顯上調(Fig 3C)。此外，內質網應激HepG2和Hep3B釋放的外泌體不僅可顯著升高RAW264.7細胞的IL-6的表達水平，而且還可以提高IL-10表達(Fig 3D，3E)。上述證據表明，內質網應激的肝癌細胞可通過分泌外泌體促進巨噬細胞向M2表型轉化，進而促進腫瘤進展。

3.4 Exo-TM上調巨噬細胞中TLR4的表達為進一步探討Exo-TM促進巨噬細胞M2極化的具體機制，我們分別使用Exo-con和Exo-TM與巨噬細胞共培養24 h。通過Affymetrix基因芯片檢測，我們發現與Exo-con組相比，Exo-TM作用后巨噬細胞中分別有129個基因表達上調和123個基因下調(Fig 4A)。生物信息學分析發現，這些差異基因與TLR級聯反應關系最為密切，如TLR6-TLR2級聯反應、TLR1-TLR2級聯反應、MYD88和TLR4信號通路等(Fig 4B)。雖然多數研究認為，TLR4通路活化可促進巨噬細胞M1轉化，但近年來已在多個腫瘤中發現TLR4活化也可促進巨噬細胞向M2b表型轉化[11]。因此，我們通過流式細胞術檢測Exo-TM介導的RAW264.7細胞M2極化是否也伴隨著TLR4信號途徑的激活。我們將HepG2細胞或Hep3B細胞中富含HSP70的外泌體與RAW264.7細胞共培養24 h，發現Exo-con和Exo-TM都可以明顯上調巨噬細胞上TLR4的表達，并且在HepG2細胞內Exo-TM使TLR4表達增加的程度比Exo-con組更為顯著，差異有統計學意義(P<0.01)，見Fig 4C和4D。上述證據表明，內質網應激的肝癌細胞可能通過釋放外泌體促進巨噬細胞向M2型極化，但具體機制仍需進一步研究。

Fig 3 Macrophages transformed to M2 phenotype promoted by Exo-TM

4 討論

內質網應激在多種腫瘤中激活，并與基因組不穩定性、血管生成和細胞化學抵抗等多種惡性生物學行為有關。內質網應激的樹突狀細胞上調促炎因子和免疫抑制酶的產生，并抑制其將抗原交叉呈遞給CD8+T細胞的能力[12]，且內質網應激的乳腺癌細胞培養基可促進巨噬細胞向促腫瘤表型轉化[13]。因此，靶向ERS有望成為腫瘤免疫治療的新策略。本研究中我們發現，內質網應激的HCC細胞釋放的外泌體可促進巨噬細胞向M2表型轉化(Fig 3)。此外，我們還發現內質網應激的HCC細胞可以釋放出更多的富含HSP70的外泌體，蛋白質譜分析也發現相似的結果(未發表)。HSP70被認為是哺乳動物細胞中最重要的HSPs，也是研究最深入的HSPs家族，在協同免疫中起著重要的作用。一些研究者在黑色素瘤小鼠模型使用結核分枝桿菌衍生的細胞外DnaK(哺乳動物Hsp70的細菌直系同源物)，發現它可以通過IL-10/IL-10R信號通路促進小鼠巨噬細胞的極化[14]，表明內質網應激相關外泌體中攜帶的HSP70可能與巨噬細胞極化密切相關。

TLR4的表達與肝癌的預后不良和患者的整體生存有關。有研究報道，腫瘤微環境可以通過TLR4依賴性的方式誘導巨噬細胞向M2型轉化，TLR4可能是巨噬細胞中內質網應激的一種傳感器[15]。因此，推測ERS相關的外泌體通過激活巨噬細胞TLR4途徑促進巨噬細胞極化。本研究中我們發現，巨噬細胞可有效地攝取外泌體，并明顯增加巨噬細胞上TLR4的表達，促進巨噬細胞向M2型轉化(Fig 3、4)。紫杉醇可通過TLR4依賴性途徑將M2型腫瘤相關巨噬細胞重新編程為M1型，調節腫瘤相關巨噬細胞的分布。我們的研究表明，肝癌細胞來源的外泌體可上調巨噬細胞表面TLR4水平并促進巨噬細胞向M2極化，這與Toll 樣受體的激活可以促進結腸癌移植瘤小鼠巨噬細胞M1轉化以及抑制腫瘤等文獻報道結果相反，表明TLR4在不同環境下可能發揮不同的作用[16]。正因為TLR4受體的雙重免疫調控作用，越來越多的制藥公司正在開發TLR4拮抗劑如類似于脂多糖結構的厄里特蘭[17]，其通過抑制Toll樣受體活性，調控炎癥反應和免疫效應。此外，vega等[18]發現，與重組HSP70相比，外泌體中HSP70在激活巨噬細胞的過程中表現出強而特異性的特征，這與我們在實驗中發現的結果相似，見Fig 3。然而ERS相關外泌體被巨噬細胞攝取后，能否提供其攜帶的HSP70，上調巨噬細胞表面TLR4受體，促進巨噬細胞M2極化，還需要進一步探討。

Fig 4 TLR4 expression in macrophages up-regulated by Exo-TM

綜上所述，本研究結果表明，內質網應激肝癌細胞分泌的外泌體富含HSP70，這些外泌體可能通過激活巨噬細胞中的TLR4途徑來增強炎癥因子的分泌并促進巨噬細胞向M2型的轉化，但具體機制仍需要進一步研究。我們的結果豐富了內質網應激促進肝癌細胞免疫逃逸的認識，并為通過靶向內質網應激、外泌體和巨噬細胞治療肝細胞癌提供了實驗依據。