IL-22/IL-22BP軸在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用

周 恒，黃三雄，賀 穎，何曉瑋，郭 璐，魯 晟

(湖州市第一人民醫院，湖州師范學院附屬第一醫院1.藥劑科、2.肝膽胰外科、3.中心實驗室，浙江 湖州 313000)

肝臟缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是肝移植、失血性休克及肝切除等肝臟手術中不可避免的過程[1]。作為一種嚴重的并發癥，缺血/再灌注損傷是造成術后肝功能不全及肝移植術后早期肝功能衰竭的重要原因之一[2]。然而，當前對肝臟IRI的研究仍不夠完全，具體作用機制尚不完全清楚[3]，且目前尚無公認有效的干預治療方法[2,4]，因此，進一步深入對肝臟IRI及其潛在機制的研究對肝臟外科的發展尤為必要。

白細胞介素22(interleukin 22, IL-22)自2000年被發現以來，其在多種類型肝損傷，包括缺血/再灌注損傷中的保肝作用被陸續發現[5]。IL-22結合蛋白(IL-22 binding protein, IL-22BP)是一種可溶性IL-22受體，與IL-22的親和力比膜受體(IL-22R1)高20-1 000倍，可通過阻止IL-22與膜受體的結合而起到抑制IL-22的作用[6-8]。近年有研究發現體內IL-22/IL-22BP軸的失衡與多種疾病的發生關系密切，但其在具體疾病中的具體作用尚不能完全闡明[9-11]。

本研究通過在小鼠建立不同時間肝臟缺血(30、90和150 min)/再灌注模型，以模擬患者肝臟遭受不同程度缺血/再灌注損傷。通過檢測肝損傷程度、體內IL-22/IL-22BP表達及信號轉導子及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)通路激活情況，探討IL-22/IL-22BP軸在肝臟缺血/再灌注損傷中的作用及可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物8-10周齡C57BL/6雄性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，SPF級。

1.2 藥物與試劑重組小鼠IL-22(上海近岸科技有限公司，批號：C047)，小鼠IL-22 ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司，批號：CME0033)，STAT3(批號：9139S)、p-STAT3(Tyr 705，批號: 9145S)和cyclinD1(批號：2922S)一抗抗體購自于CST公司(美國)。

1.3 主要儀器血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性水平由自動化學分析儀(Hitachi3100，日本)測定。

2 方法

2.1 動物造模小鼠隨機分為4組：短時間肝臟缺血/再灌注組(ST-IRI)，中等時間肝臟缺血/再灌注組(MT-IRI)，長時間肝臟缺血/再灌注組(LT-IRI)以及長時間肝臟缺血/再灌注+IL-22治療組(LT-IRI-IL-22)。肝臟IRI造模具體方法可參照[5]。短、中、長時間缺血模型缺血時間分別為30、90和150 min。再灌注后不同時間點(6、12、24和48 h)安樂死小鼠，獲取肝臟、血清等組織用于后續研究。

2.2 肝損傷檢測小鼠肝損傷分析通過檢測血清ALT、AST活性，測算肝指數(肝質量/體質量，LW/BW)以及HE病理染色分析等方法。

2.3 實時定量PCR(q-PCR)應用TRIzol法抽提肝臟RNA后，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒(批號：RR036A)操作說明生成cDNA，最后利用SYBR green premix(康為世紀生物技術有限公司)反應體系定量PCR。引物序列如下，18S：For 5′-GTAAC CCGTTGAACCCCATT-3′, Rev 5′-CCATCCAATCGGT AGTAGCG-3′; IL-22Rα1：For 5′-TTACTACGCCAAG GTCACGG-3′，Rev 5′-GGCGGTTTGATGGTAGTGTG-3′; IL-22BP：For 5′-CGAGCTGTATTACGGGAGGG-3′，Rev 5′-CGGAGGATCTAGTTTTGTTTCCC-3′。

2.4 免疫印跡利用RIPA 組織裂解液獲取肝臟組織總蛋白，BCA法定量蛋白。取60 μg蛋白/樣本行電泳、轉膜、封閉以及一抗、二抗孵育。其中一抗稀釋比例：p-STAT3(1 ∶2 000)，STAT3(1 ∶1 000)，cyclinD1(1 ∶1 000)。蛋白條帶定量分析應用ImageJ v1.6.0軟件。

2.5 HE染色將獲取的部分肝臟組織固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切片(厚4 μm)，并對切片行HE染色[5]。簡言之，肝組織切片依次浸入二甲苯(15 min/次×2次)、100%乙醇(5 min/次×2次)及95%、80%乙醇和水中(各5 min)。在蘇木精溶液和伊紅中各染色5 min、10 s，清洗后在不同濃度乙醇中浸泡后封片。

2.6 統計學處理SPSS軟件(v19.0)用于數據統計。所有數據均表示為均數±標準差，兩組間均值比較采用t檢驗，多組間比較采用one-way ANOVA。

3 結果

3.1 肝臟缺血/再灌注損傷上調血清IL-22水平，誘導肝內STAT3通路激活ELISA檢測結果顯示，同假手術組(Sham)相比，缺血/再灌注組(IRI，缺血90 min)在再灌注后6 h血清IL-22濃度明顯升高(Fig 1A)。Western blot檢測進一步發現，同Sham組比較，IRI組在再灌注后6 h肝組織p-STAT3蛋白表達增加明顯，表明缺血/再灌注損傷明顯誘導了肝內STAT3通路的激活(Fig 1B，1C)。

3.2 不同缺血時間對再灌注后肝損傷的影響為了研究不同缺血時間對再灌注后肝損傷的影響，隨機將小鼠分為3組：短時間缺血/再灌注組(ST-IRI，缺血30 min)、中等時間缺血/再灌注組(MT-IRI，缺血90 min)及長時間缺血/再灌注組(LT-IRI，缺血150 min)。研究顯示，同ST-IRI組相比，MT-IRI及LT-IRI組小鼠在再灌注后12 h血清ALT、AST活性明顯增加(Fig 2A，2B)，而在再灌注后6 h肝指數(肝重/體重)升高明顯，其中LT-IRI升高最為明顯(Fig 2C)。HE染色結果(Fig 2D)顯示, 在再灌注后12 h，同ST-IRI組相比，MT-IRI及LT-IRI組肝組織可見更大范圍的梗死灶及更多邊緣浸潤的炎性細胞，表明在一定范圍內，肝臟隨著缺血時間延長，在再灌注后表現出更為嚴重的肝損傷。

Fig 1 Serum IL-22 level up-regulated and hepatic STAT3 pathway activated by liver

Fig 2 Effects of different ischemia time on liver injury after reperfusion

3.3 不同缺血時間對再灌注后血清IL-22及肝內STAT3通路激活的影響ELISA檢測發現，同ST-IRI及MT-IRI組相比，LT-IR組小鼠在再灌注后6 h血清IL-22濃度升高明顯，差異具有統計學意義，而ST-IRI與MT-IRI組差異并不明顯(Fig 3A)。PCR結果可見，同ST-IRI及LT-IRI組相比，MT-IR組在再灌注后6 h肝組織IL-22受體α1(IL-22Rα1)mRNA表達最少(Fig 3B)。Western blot結果可見同MT-IRI及LT-IRI組相比，ST-IR組在再灌注后6 h肝組織p-STAT3及cyclinD1蛋白表達增加明顯，提示ST-IRI組肝內p-STAT3通路被明顯激活(Fig 3C，3D)。

3.4 不同缺血時間對再灌注后肝內IL-22BP表達的影響利用PCR技術檢測肝內IL-22BP mRNA表達情況，試圖揭示不同缺血時間對肝內IL-22BP表達的影響。結果如圖Fig 4A所示，同IL-22Rα1 mRNA表達類似，IL-22BP mRNA在MT-IRI組表達明顯下調，進一步研究發現，隨著缺血時間的延長，IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值不斷增加，差異具有統計學意義(Fig 4B)。

3.5 外源性重組IL-22的治療減輕小鼠肝臟缺血/再灌注損傷為了更加直接的研究IL-22在肝臟IRI損傷中的作用，給予長時間缺血組(LT-IRI)小鼠以外源性重組IL-22治療。給藥方法為手術前30 min尾靜脈注射(0.125 μg·g-1)。同LT-IRI相比，LT-IRI-IL-22小鼠在再灌注后6 h，血清IL-22濃度明顯增加(Fig 5A),同時肝損傷明顯減輕，表現為更低的血清ALT、AST活性和更輕微的組織學變化(Fig 5B-D)。Western blot結果同我們預期一致，即LT-IRI-IL-22組再灌注后6 h肝內STAT3通路被明顯激活,表現為顯著增加的p-STAT3蛋白的表達(Fig 5E，5F)。

Fig 3 Effects of different ischemia time on serum IL-22 concentration and STAT3 pathway activation after reperfusion

Fig 4 Effect of different ischemia time on expression of IL-22BP in liver after reperfusion

Fig 5 The hepatic ischemia-reperfusion injury of mice treated with exogenous recombinant IL-22 significantly alleviated 6 h after reperfusion

4 討論

本研究中我們發現肝臟IRI能夠明顯升高血清IL-22水平并促進肝內STAT3通路的激活。相比ST-IRI組，MT-IRI和LT-IRI組表現出更為嚴重的再灌注損傷。盡管再灌注后LT-IRI組血清IL-22濃度升高最為明顯，但其肝內STAT3通路的激活卻被明顯抑制。進一步的研究發現，相比另外兩組，MT-IRI組肝臟IL-22Rα1和IL-22BP mRNA表達量均明顯減少，但3組的IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值卻隨著缺血時間的延長表現出明顯增加趨勢，差異具有統計學意義。當給予外源性重組IL-22，遭受長時間缺血/再灌注損傷的小鼠肝損傷明顯減輕，肝內STAT3通路的激活也顯著上調。

IL-22在不同組織器官中的作用被陸續報道，然而對體內誘導該細胞因子表達的研究仍然不足。有動物研究報道顯示部分肝切除手術(partial hepatectomy, PHx)術后早期小鼠血清IL-22及肝組織IL-22R mRNA水平明顯升高[12]，另一項研究發現在藥物性肝損傷和急性失代償期肝硬化人類患者血清及肝臟中也檢測出高水平的IL-22表達[13-14]，表明肝臟手術或損傷或可誘導內源性IL-22產生。通過建立小鼠肝臟IRI模型，我們證實IRI可明顯升高小鼠血清IL-22濃度，進一步研究顯示肝臟IRI后STAT3信號通路被明顯激活，這或許與IL-22產生增加有關。

IL-22BP是一種可溶性IL-22受體，缺乏跨膜和細胞內結構域[6]。近年來IL-22BP在肝臟中的作用逐漸引起研究者的重視。有研究報道，與IL-22類似，在肝硬化患者血清中同樣檢測到升高的IL-22BP[9,13]。體外研究顯示，IL-22BP可顯著抑制IL-22誘導的Huh-7和HepG2細胞STAT3通路的激活，當IL-22BP/IL-22濃度比值達到10或50或更高時，IL-22誘導的STAT3的激活可被完全阻斷[13]。高IL-22水平和低IL-22BP/IL-22比值與肝硬化患者慢性肝衰竭急性發作(acute-on-chronic liver failure, ACLF)及死亡率密切相關[13]。來自德國的研究團隊得出了類似的結論，指出IL-22BP基因缺陷的小鼠對肝臟缺血/再灌注損傷更加敏感，并且在接受APAP之后引起更為嚴重的肝損傷[15]。表明IL-22BP在不同類型肝損傷中發揮作用，可能是通過抑制IL-22的活性實現的[16]。我們發現隨著缺血時間的延長，肝組織IL-22BP mRNA表達并沒有呈現增加或減少趨勢，而是表現為“兩頭高中間低”的趨勢，IL-22Rα1 mRNA表達趨勢與IL-22BP mRNA類似。盡管如此，IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值卻隨著缺血時間的延長而不斷明顯增加，差異具有統計學意義。IL-22BP與IL-22的親和力遠高于膜受體，可通過阻止IL-22與膜受體的結合而起到抑制IL-22的作用[6]，這或許是IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值增加導致肝損傷不斷加重的原因之一。

IL-22在急性肝損傷時具有保肝作用，但在慢性肝損傷中的作用仍存在爭議，這種具有環境依賴性的雙刃劍作用取決于疾病類型、發展階段及特定的組織微環境(尤其是內源性調控IL-22活性的細胞因子)。但是，目前我們對此仍然知之甚少[17]。IL-22BP作為內源性調控IL-22活性的重要因素之一，我們證實了IL-22BP/IL-22Rα1 mRNA比值在肝臟缺血/再灌注損傷中的消極作用，對深入并豐富IL-22在肝損傷中的作用及為尋找新的、更為安全有效的保肝藥物提供實驗依據，為開發以IL-22及其相關通路或調節蛋白為靶點的新治療措施奠定基礎。