松油烯-4-醇抑制神經膠質瘤U87和U251細胞增殖、遷移與侵襲并促進其凋亡

詹 琪，曾智銳，任長城，凌園果，曾 茜，劉孟濤，徐卡婭，出良釗，劉 健,5

(貴州醫科大學 1.臨床醫學院、2.基礎醫學院生理學教研室，3.貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，4.貴州醫科大學附屬醫院神經外科，5.貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550004)

神經膠質瘤(glioma)是最常見的中樞神經系統原發性腫瘤[1]，由多種因素相互作用導致，具有高度侵襲性、代謝異常和血管生成等惡性生物學特征[2]，惡性膠質瘤病死率極高，其中位生存時間僅約15個月，有著較高的復發率，手術切除是主要的治療手段，術后的輔助分級放療結合化療也占據很重要的地位。目前一線化療藥替莫唑胺療效明顯，但受限于耐藥性[3-4]，因此，研發新藥物對治療神經膠質瘤具有重大的臨床意義。

蛋白質酪氨酸磷酸酶非受體型1和2(PTPN1、PTPN2)屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，一直被認為對胰島素和瘦素受體信號傳導有負調控作用[5]。近期報道，它在癌細胞中異常表達，并作為一種重要的癌基因發揮作用，PTPN1促進增殖、集落形成和遷移，而降低癌細胞系的凋亡[6]。PTPN2在膠質瘤中表達顯著增高，在T98G細胞中沉默PTPN2基因明顯抑制細胞集落形成和誘導細胞凋亡,能夠抑制膠質瘤細胞的生長[7],故PTPN1/2有望成為抗膠質瘤藥物作用的蛋白靶點。

從植物材料中提取的精油及其成分已被發現具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol，化學式：C10H18O,T4O)是精油的主要有效成分之一。近期報道表明，T4O通過選擇性誘導抗腫瘤作用，在黑色素瘤細胞系中引起細胞死亡和細胞周期阻滯[8]。但T4O在膠質瘤中存在何種作用與機制暫未知。本研究擬探討T4O對神經膠質瘤U87與U251細胞惡性生物學行為的影響與潛在作用靶點，優化膠質瘤治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 神經膠質瘤細胞U87與U251購自中國科學院上海細胞庫

1.1.2試劑 DMEM高糖培養液(貨號：A4192101)、胎牛血清(貨號：10099141C)和2.5 g·L-1胰蛋白酶(貨號：25200-056)購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO，貨號：D2650)、細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CCK-8，貨號：CA1210)、結晶紫染色液(貨號：G1063)、蛋白裂解液RIPA(貨號：R0020-100)、蛋白酶抑制劑PMSF(貨號：P0100)和BCA蛋白定量試劑盒(貨號：PC-0020-500)購自北京索萊寶生物工程有限公司；Transwell小室(貨號：3422)購自北京明陽科華生物科技有限公司；SDS-PAGE制膠試劑盒(貨號：P0690)與Annexin-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062L)購自上海碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號：PR30019)以及兔源性多克隆抗體PTPN1(貨號：11334-1-AP)、PTPN2(貨號：11214-1-AP)、Bcl-2(貨號：12789-1-AP)、Bax(貨號：50599-2-Ig)、caspase-3(貨號：19677-4-AP)、MMP-2(貨號：10373-2-AP)、MMP-9(貨號：10375-2-AP)與鼠源性β-actin單克隆抗體(貨號：66009-1-Ag)購自武漢三鷹生物技術有限公司；極超敏ECL化學即用型底物曝光液(貨號：AR1190)購自武漢博士德生物公司；松油烯-4-醇(純度>98%)(貨號：329-52972)購自天津一方科技有限公司。

1.1.3儀器 超凈工作臺(型號：SW-CJ-2FB)購自上海滬靜醫療器械有限公司；恒溫培養箱(型號：DHP-9032(A))購自上海飛越實驗儀器公司；多功能酶標儀(SpectraMax M3)購自美國Molecular Devices公司；倒置顯微鏡(型號：XDS-3)購自上海精密儀器儀表有限公司；搖擺搖床(型號：SHRK07AL1)購自深圳現代豪方儀器儀表科技有限公司；Novocyte型流式細胞儀(型號：D2060R)購自杭州艾森生物有限公司；Western blot凝膠成像系統(型號：FluorChemM)購自北京創博環球生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 神經膠質瘤細胞U87和U251添加含10% FBS 的DMEM高糖培養基，放置于37 ℃、含5% CO2的精密恒溫培養箱中培養。常規隔日更換新鮮培養基。匯合度達0.8以上，則進行消化傳代以及凍存操作。

1.2.2用CCK-8法檢測T4O對細胞增殖的影響 將神經膠質瘤細胞株U87和U251(均2×103個/孔)種于96孔板上。分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞，每組設置6個復孔。24 h后，取CCK-8液與含10% FBS的DMEM培養基以1 ∶9的比例混勻；96孔板棄去原培養液，每孔加入100 μL的混合液，放置恒溫培養箱，時長為2 h。將多功能酶標儀中波長調至450 nm并讀取吸光度(OD值)。各組相對增殖率/%=(觀察組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3克隆平板法檢測T4O對細胞克隆形成能力的影響 神經膠質瘤細胞U87和U251(均1×103個/皿)接種于細胞培養皿(直徑=6 cm)上。細胞貼壁后，分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。15 d后，棄培養液，4 %多聚甲醛溶液固定20 min，隨后0.5%結晶紫常溫染色20 min。置于烘箱烤干后拍照記錄。計算各組細胞克隆形成數。

1.2.4流式細胞術檢測T4O對膠質瘤細胞凋亡的影響 用胰蛋白酶消化U87與U251細胞后，按照1×104個/孔的密度接種于6孔板中。以濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理24 h后，棄培養液，用1×PBS洗2次，每孔加入1 mL不含EDTA的胰酶消化后，4 ℃離心5 min收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，4 ℃離心5 min，收集1 × 105細胞，吸棄PBS，加1×Binding Buffer 100 μL重懸細胞，添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，混勻后避光反應20 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后置于冰上，于流式細胞儀檢測。其中，Q1象限區域是機械損傷所導致死亡細胞百分比，Q2象限區域是晚期凋亡細胞百分比,Q3象限區域是早期凋亡細胞百分比，Q4象限區域是存活細胞百分比。

1.2.5劃痕愈合實驗檢測T4O對神經膠質瘤細胞遷移能力的影響 神經膠質瘤細胞株U87和U251(均2 × 105個/孔)接種于6孔板上。待細胞匯合度達90%時，以無血清培養液饑餓細胞24 h。以200 μL移液器槍頭在細胞單層上劃一直線。PBS 洗3次以清除漂浮的細胞，倒置顯微鏡下記錄 0 h劃痕的情況。分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。恒溫培養箱中培養細胞24 h后再次記錄劃痕情況。ImageJ軟件測量劃痕0 h和24 h的面積，24 h內劃痕的愈合面積為同一處理組0 與24 h劃痕的面積之差。相對遷移率/%=各藥物處理組24 h內愈合面積/對照組24 h內愈合面積×100%。

1.2.6Transwell小室法檢測T4O對神經膠質瘤細胞侵襲能力的影響 共300 μL的神經膠質瘤細胞U87和U251的細胞懸液(含2×105個細胞)加入到預先鋪好Matrigel的Transwell上室里，然后分別用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理細胞。Transwell下室中加入700 μL的完全培養液(含10%FBS)作為誘導物。在恒溫培養箱中放置24 h后，棄去舊培養液，用4 %多聚甲醛溶液常溫固定細胞20 min和0.5%濃度的結晶紫常溫染色20 min。PBS洗掉殘留結晶紫后，在烤箱烘干殘留水分。每孔隨選4個視野(× 100)，于顯微鏡下拍照記錄并計數侵襲細胞數。

1.2.7生物信息學預測與分析T4O作用靶點 根據T4O的藥效團，利用Swissprediction軟件，預測T4O作用的蛋白靶點，獲取靶點后應用 Cytoscape 軟件可視化T4O調控的靶點。隨后利用公共數據庫GEPIA分析靶點的表達量與神經膠質瘤患者總生存率的關系。P<0.05則認為靶點的表達量與患者的總體生存率相關。與患者總體生存率相關的靶點則認為是T4O在神經膠質瘤中重要的作用靶點。

1.2.8蛋白質印跡法檢測PTPN1、PTPN2以及其下游與增殖、轉移相關蛋白的表達 神經膠質瘤U87和U251細胞用濃度為0(即DMSO處理的對照組)、1、2和4 μmol·L-1的T4O處理24 h后，用含 1% PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，收集蛋白液后以BCA法定量。蛋白(20 μg)加入到10%的 SDS-PAGE膠中，120 V恒壓電泳1.5 h，300 mA恒流轉膜2 h至PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后，分別加入稀釋度為1 ∶1 000的兔源性PTPN1多克隆抗體、兔源性PTPN2多克隆抗體、兔源性Bcl-2多克隆抗體、兔源性Bax多克隆抗體、兔源性pro-caspase-3多克隆抗體、兔源性cleaved caspase-3多克隆抗體、兔源性MMP-2多克隆抗體、兔源性MMP-9多克隆抗體以及鼠源性β-actin單克隆抗體，在4 ℃條件下放置搖床過夜。用TBST洗滌3次，15 min/次，以1 ∶1 500的體積稀釋比稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或鼠 IgG后加入，進行室溫孵育2 h，后用TBST洗滌3次，15 min/次。曝光后檢測各蛋白條帶的灰度值，重復3次。

2 結果

2.1 T4O抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的增殖CCK-8檢測結果(Fig 1)顯示，0(即DMSO對照)、1、2 和4 μmol·L-1的T4O處理 24 h后，U87細胞的相對增殖率分別為(99.25±2.60)%、(87.47±2.63)%、(76.24±1.78)% 和(64.72±3.03)%；U251細胞的相對增殖率分別為(100.03±1.88)%、(85.70±3.79)%、(73.52±6.60)% 和(57.41±5.71)%。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的增殖率均出現明顯減少，差異具有統計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的增殖。

Fig 1 Effects of different concentrations of T4O on 24 h proliferation of glioma U87 and U251 cells detected by CCK-8

2.2 T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的克隆形成能力克隆平板實驗結果(Fig 2)顯示，0(即DMSO對照)、1、2 和 4 μmol·L-1的T4O處理組中，U87細胞克隆形成數依次為(886±14)個、(782±10)個、(417±11)個和(102±3)個；U251細胞克隆形成數依次為(894±14)個、(743±15)個、(121±20)個和(46±8)個。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的克隆形成數均出現明顯減少，差異具有統計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的克隆形成能力。

2.3 T4O明顯促進神經膠質瘤U87和U251細胞的凋亡流式細胞凋亡實驗結果(Fig 3)顯示，0(即DMSO對照)和 1、2、4 μmol·L-1的T4O處理24 h后, U87細胞凋亡率分別為(1.34±0.03)%、(4.10±0.06)%、(7.93±0.10)% 和(11.56±0.53)%；U251細胞凋亡率分別為(2.09±0.07)%、(3.55±0.12)%、(6.38±0.13)%和(6.71±0.07)%。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的凋亡率均出現明顯增加，差異具有統計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯促進神經膠質瘤U87和U251細胞的凋亡。

2.4 T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的遷移劃痕愈合實驗結果(Fig 4)顯示，0(即DMSO對照)和 1、2、4 μmol·L-1的T4O處理 24 h 后，U87細胞的相對遷移率分別為(99.99±1.33)%、(71.47±1.87)%、(42.07±1.55)%和(32.51±1.57)%；U251細胞的相對遷移率分別為(100.10±1.56)%、(73.84±5.18)%、(50.48±4.38)%和(25.19±2.23)%。與對應細胞系的對照組相比，各濃度松T4O處理組細胞的相對遷移率均出現明顯減少，差異具有統計學意義(P均<0.05)。提示，T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的遷移能力。

Fig 2 Effects of T4O on colony formation of glioma U87 and U251 cells detected by colony formation assay n=3)

Fig 3 Effects of T4O on U87 and U251 cell apoptosis detected by flow cytometry n=3)

2.5 T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的侵襲Transwell小室實驗結果(Fig 5)顯示，0(即DMSO對照)和1、2、4 μmol·L-1的T4O處理24 h, U87細胞每視野下侵襲過膜的細胞數為(389±11)個、(282±9)個、(184±7)個 和(45±5)個；U251細胞侵襲過膜的細胞數為(325±8)個、(174±10)個、(107±4)個和(17±4)個。對比對照組，各濃度T4O處理組細胞的每視野下侵襲過膜細胞數均出現明顯減少，差異具有統計學意義(P均<0.05)。提示T4O明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的侵襲能力。

Fig 4 Effects of T4O on glioma U87 and U251 cell migration determined by Scratch healing test (×40) n=3)

Fig 5 Effects of T4O on invasion of glioma U87 and 251 cells determined by Transwell experiments (×100) n=3)

2.6 T4O的作用靶點預測與分析根據T4O的藥效團，我們利用Swissprediction軟件，預測其作用靶點。發現T4O有37個作用靶點(Fig 6A)。進一步，我們利用公共數據庫GEPIA分析靶點與神經膠質瘤進展的關系。發現：靶點PTPN1和PTPN2高表達的神經膠質瘤患者總體生存率較低(Fig 6B)。提示PTPN1和PTPN2可能是T4O在神經膠質瘤中的重要作用靶點。

2.7 T4O對PTPN1、PTPN2、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、MMP-2與MMP-9表達的影響用不同濃度(0、1、2、4 μmol· L-1)的T4O處理神經膠質瘤U87和U251細胞后，免疫印跡法檢測結果(Fig 7)顯示，與各細胞系的對照組(即0 μmol·L-1的T4O組)相比，各濃度處理組PTPN1、PTPN2、MMP-2、MMP-9與Bcl-2的相對表達量均見明顯減少，cleaved caspase-3與Bax蛋白的相對表達量均見明顯增加，差異均具有統計學意義(P<0.05)。提示T4O顯著抑制其在神經膠質瘤中的關鍵靶點蛋白PTPN1和PTPN2的表達以及下游相關增殖遷移和侵襲相關指標。

Fig 6 Prediction of protein target of T4O action(A)and relationship between target protein and glioma progression(B)

Fig 7 Effects of T4O on expression of PTPN1, PTPN2, Bcl-2, Bax, pro-caspase-3, cleaved caspase-3, MMP-2 and MMP-9 protein in U87 and U251 cells detected by Western blot n=3)

3 討論

腦部最常見腫瘤類型為神經膠質瘤，惡性膠質瘤危害極高，最主要生物特性為侵襲性，患者5年生存率處于較低水平，表明膠質瘤的臨床治療面臨巨大挑戰。臨床上用于治療膠質瘤的藥物有很多，如替莫唑胺,其在低級別膠質瘤中展示出了較好的療效，但面對級別較高的膠質母細胞瘤，易產生耐藥與復發，因此尋找新的、安全的并且有效的抗不同級別膠質瘤藥物是基礎和臨床研究的一項關鍵任務[9]。

T4O是從中藥姜黃中提煉出的一種豐度較高的松油烯類有效成分[10]。T4O目前在臨床上主要作為治療皮膚真菌病及寄生蟲感染藥物，可內服或外敷，安全性高，毒副作用少[11]。臨床上，多種松油烯類物質已成功地用作抗癌化療藥物，如長春新堿和紫杉醇等。潛在表明，骨架結構為松油烯類的化合物如T4O等可能也具有抗腫瘤作用。近些年研究也證實這一推測。如T4O能夠抑制人黑色素瘤細胞的生長，并對其耐藥變異體更有效，它們在質膜中表達高水平的P-糖蛋白，克服了P-糖蛋白陽性腫瘤細胞對caspase依賴性凋亡的抗性[12]。再如T4O誘導細胞色素C從線粒體釋放和Bid蛋白在caspase-8刺激后被切割，從而誘導人白血病HL-60細胞自噬與凋亡[13]。本研究以神經膠質瘤U87(起源于高級別的神經膠質瘤)和U251細胞(起源于低級別的神經膠質瘤)為細胞模型，發現T4O均明顯抑制神經膠質瘤U87和U251細胞的增殖、侵襲與遷移，并誘導了其凋亡，表明T4O在低級別膠質瘤與高級別膠質瘤中均具有明顯療效。提示T4O是一種良好的抗神經膠質瘤藥物。

蛋白質酪氨酸磷酸酶類(PTPs)是負責催化酪氨酸去磷酸化這一過程，PTPN1與PTPN2是PTPs的眾多類型中很常見的兩種類型，他們的催化結構域具有>74%的一致性[14]。近期大量研究表明PTPN1、PTPN2在膠質瘤中的表達異常增高且與患者不良預后相關[15]。Tao等[16]發現PTPN1在膠質瘤組織中過度表達，并且通過MAPK/ERK和PI3K/AKT通路促進膠質瘤的進展；Wang等[17]研究表明，PTPN2在膠質母細胞瘤中的表達水平升高，與IDH野生型和間充質亞型膠質瘤有關，并與膠質瘤的免疫應答和炎癥反應密切相關。本研究中，基于藥效團模型，運用生物信息學手段發現PTPN1與PTPN2為T4O的作用靶點，且PTPN1和PTPN2高表達的神經膠質瘤患者總體生存率較低。提示：PTPN1和PTPN2是T4O在神經膠質瘤中的重要作用蛋白，其發揮生物學功能可能是通過抑制PTPN1和PTPN2介導的。進一步通過Western blot發現，T4O能夠明顯抑制PTPN1與PTPN2的表達，并且其下游侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9與抗凋亡因子 Bcl-2的表達量均見減少，同時增加了促凋亡因子Bax的表達量。

綜上所述，T4O可能通過靶向PTPN1與PTPN2來抑制膠質瘤的增殖、侵襲與遷移，并促進其凋亡。T4O展現了其抗膠質瘤的潛在價值，有望成為治療高低級別膠質瘤的有效藥物。