高烏頭炮制前后乙醇提取物石油醚萃取部位的GC-MS分析

馮銀平 帖曉燕 戴海蓉 張?jiān)弃Q 樊秦 李蕓

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1204-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.08

摘 要 目的：比較高烏頭炮制前后其乙醇提取物石油醚萃取部位的化學(xué)成分。方法：取高烏頭藥材用水凈制潤軟后，制得高烏頭生品飲片;取生品飲片用甘草汁經(jīng)高壓蒸制，制得高烏頭炮制品飲片;分別以95%乙醇超聲提取后再經(jīng)石油醚萃取，制得高烏頭生品、炮制品乙醇提取物石油醚萃取部位。采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析兩者的化學(xué)成分;采用NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫進(jìn)行化合物對比、匹配;采用峰面積歸一化法測定各成分的相對百分含量。結(jié)果：炮制前后，高烏頭乙醇提取物石油醚萃取部位中的主要成分均為脂肪酸及其酯類。其中，高烏頭生品飲片中共檢測出18個(gè)色譜峰，鑒定出13個(gè)化合物，占生品揮發(fā)性成分總量的94.60%，以（Z，Z，Z）-9，12，15-十八烷三烯酸（26.13%）、十六酸乙酯（25.27%）、棕櫚油酸（10.84%）、亞油酸乙酯（10.67%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸甲酯（6.66%）、十五烷酸（5.11%）的相對百分含量較高;高烏頭炮制品飲片中共檢測出25個(gè)色譜峰，鑒定出18個(gè)化合物，占炮制品揮發(fā)性成分總量的82.40%，以棕櫚油酸（18.95%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸甲酯（17.93%）、十六酸乙酯（11.94%）、（Z，Z，Z）-9，12，15-十八烷三烯酸（10.54%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸（5.51%）、（Z）-11-十六烷烯酸（5.30%）的相對百分含量較高。炮制后新增7種成分，共鑒定出其中5種，分別為（-）-藍(lán)桉醇、2-甲基十四酸乙酯、6-甲基-4苯基香豆素、β-谷甾醇、二十七烷;炮制后未有成分消失，且部分成分含量增加或減少。結(jié)論：經(jīng)炮制后，高烏頭乙醇提取物的石油醚萃取部位揮發(fā)性成分存在差異，炮制后新增（-）-藍(lán)桉醇等多種成分。

關(guān)鍵詞 高烏頭;炮制;乙醇提取物;石油醚萃取部位;氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù);化學(xué)成分

GC-MS Analysis of Petroleum Ether Fraction from the Ethanol Extract of Aconitum sinomontanum before and after Processing

FENG Yinping1，TIE Xiaoyan1，DAI Hairong1，2，ZHANG Yunhe1，F(xiàn)AN Qin3，LI Yun1（1. College of Pharmacy， Gansu University of TCM， Lanzhou 730000， China; 2. Dept. of Pharmacy， Pingliang Hospital of TCM， Gansu Pingliang 744000， China; 3. Gansu Province Key Laboratory of TCM Pharmacology and Toxicology， Gansu University of TCM， Lanzhou 730000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the chemical constituents of petroleum ether fraction from ethanol extract of Aconitum sinomontanum before and after processing. METHODS： After A. sinomontanum was purified with water， the raw product decoction pieces were prepared; the raw decoction pieces were steamed with licorice juice under high pressure to prepare processed decoction pieces of A. sinomontanum. The petroleum ether fractions of raw product and processed product were obtained after ultrasonic extraction with 95% ethanol. The chemical constituents in the samples were analyzed by GC-MS. NIST 2014 mass spectrometry database was used to compare and match the components. The peak area normalization method was used to determine the relative percentage content of each component. RESULTS： Before and after processing， fatty acids and esters were the main components in the petroleum ether fraction from ethanol extract. Totally 18 chromatographic peaks were detected in the detection pieces of raw product， and 13 compounds were identified， accounting for 94.60% of the total content of volatile components. The components with relatively high content were （Z， Z， Z）-9，12，15-octadecatrienoic acid （26.13%）， hexadecanoic acid ethyl ester （25.27%）， palmitoleic acid （10.84%）， ethyl linoleic acid （10.67%）， （Z， Z）-9，12-octadecenoic acid methyl ester （6.66%）， pentadecanoic acid （5.11%） and so on. Totally 25 chromatographic peaks were detected in the decoction pieces of processed products， and 18 components were identified， accounting for 82.40% of the total content of volatile components. The components with relatively high content were palmitoleic acid （18.95%）， （Z， Z）-9，12-octadecenoic acid methyl ester （17.93%）， hexadecanoic acid ethyl ester（11.94%）， （Z， Z， Z）-9，12，15-octadecatrienoic acid （10.54%）， （Z，Z）-9，12-octadecenoic acid （5.51%）， （Z）-11-hexadecanoic acid （5.30%） and so on. After processing， 7 new components were added， 5 of which were identified as （-）-eucalyptus globulus alcohol， ethyl 2-methyltetrade-canoate， 6-methyl-4-phenylcoumarin， β-sitosterol， heptadecane. After processing， no components disappeared， and the content of some components increased or decreased. CONCLUSIONS： After processing， the volatile components in the petroleum ether fraction from ethanol extract of A. sinomontanum are different， and （-）-eucalyptus globulus alcohol and other components are added after processing.

KEYWORDS? ?Aconitum sinomontanum; Processing; Ethanol extract; Petroleum extraction fraction; GC-MS; Chemical constituents

高烏頭為毛莨科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根，又稱麻布七、麻布袋、統(tǒng)天袋、麻布口袋等，在《中華本草》《中藥大辭典》等本草典籍中均有記載[1-2]。該藥材現(xiàn)被收載于《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，其辛、苦、溫，有毒，具祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀之功，可用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、跌打損傷等癥[3]。

高烏頭含有生物堿類、黃酮類、甾體類、糖苷類等化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)痛、局部麻醉、抗心律失常、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對高烏頭二萜類生物堿的研究較為廣泛，主要為單體化合物的提取、分離、衍生化修飾等方面[7-8]。高烏頭生品有毒，多部文獻(xiàn)均有記載[1-3]。本課題組前期對其炮制工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過炮制可以減弱其毒性[9];進(jìn)一步對其毒性部位進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，除氯仿部位毒性較大外，極性最小的石油醚部位也具有一定毒性，且該部位成分多具有揮發(fā)性[10]。中醫(yī)理論指出，“辛可行氣、發(fā)散”，表明辛味藥的物質(zhì)基礎(chǔ)多為揮發(fā)性成分[11]?；诖耍狙芯坎捎脷赓|(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對高烏頭炮制前后乙醇提取物石油醚萃取部位所含揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究其炮制前后毒性變化機(jī)理以及辛味藥物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 7890B/5977A型GC-MS聯(lián)用儀及配備的Mass-hunter質(zhì)譜工作站、NITS 2014標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫（美國Agilent公司），LDZX-30FA型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），BT125D型十萬分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)W-400A型高建萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司），HHS-11S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠），SHB-3型循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）、Buchi R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）等。

1.2 藥品與試劑

正己烷、丙酮、石油醚（60～90 ℃）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

高烏頭藥材共7批（編號S1～S7），采挖自甘肅天祝藏族自治縣朱岔峽（采集時(shí)間為2016年3-8月）;甘草飲片（批號1712201）購自泰來堂藥店;上述藥材經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院楊錫倉主任中藥師鑒定，分別為毛茛科烏頭屬植物高烏頭A. sinomontanum Nakai的干燥根、豆科甘草屬植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 高烏頭生品、炮制品飲片 取7 批高烏頭藥材，用水凈制潤軟后，切成長約為5 mm的小段，室內(nèi)常溫自然晾干，將各批藥材充分混合均勻，即得高烏頭生品飲片。取上述生品飲片，用甘草汁[取甘草180 g，加12倍量（mL/g，下同）水，煎煮1 h，濾過;藥渣再用10倍量水煎煮1 h，濾過;合并2次濾液，濃縮至甘草汁體積與甘草質(zhì)量比為3 ∶ 1，即得。甘草汁用量為每100 g生品飲片用甘草汁10 mL）]潤透后，置于立式壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，設(shè)置溫度127 ℃、壓力0.5 MPa，蒸制5 h，取出，室內(nèi)常溫自然晾干，即得高烏頭炮制品飲片[9]。

2.1.2 高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位 分別取“2.1.1” 項(xiàng)下高烏頭生品、炮制品飲片適量，加入10 倍量95%乙醇冷浸24 h后，于30 ℃超聲（功率300 W、頻率40 kHz，下同）處理45 min，同法重復(fù)提取2 次，濾過，合并2次濾液，減壓回收乙醇，即得高烏頭乙醇提取物。取上述高烏頭乙醇提取物，加水制成混懸液，用石油醚萃?。?00 mL×4 次），于35 ℃下減壓回收石油醚，濾過，即得高烏頭生品、炮制品飲片石油醚萃取部位[12]。

2.1.3 樣品溶液 分別取“2.1.2”項(xiàng)下高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位243.59、241.15 mg，加石油醚溶解并定容至5 mL，即得質(zhì)量濃度分別為48.72、48.23 mg/mL的高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位樣品溶液。

2.2 高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位的GC-MS分析

2.2.1 GC條件 以Agilent HP-5MS毛細(xì)管（30 m×0.25 mm，0.25 μm）為色譜柱;進(jìn)樣口溫度為290 ℃;流速控制模式為線速度控制，流速為1.0 mL/min;程序升溫（起始溫度80 ℃，以18 ℃/min升溫至180 ℃;以2 ℃/min升溫至193 ℃，保持10 min;以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min;以2 ℃/min升溫至300 ℃，保持4 min）;載氣為高純度氦氣（99.999%）;分流進(jìn)樣，分流比為10 ∶ 1，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2.2 MS條件 離子源為電子轟擊源（EI）;電離能量為70 eV;離子源溫度為200 ℃;接口溫度為280 ℃;采集延時(shí)為3 min;以全掃描模式進(jìn)行掃描，掃描范圍為m/z 40～500。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 分別精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位樣品溶液和甘草汁（按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得）各1 μL，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，得總離子流圖（圖1）。通過檢索對比NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，對匹配度≥90的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，對比鑒定化合物;采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對百分含量，結(jié)果見表1（表中，“/”表示未鑒定出具體化合物;“-”表示未檢測出該化合物）。

由表1可知，高烏頭生品、炮制品飲片乙醇提取物石油醚萃取部位主要成分為脂肪酸及其酯類。高烏頭生品飲片中共檢測出18個(gè)色譜峰，鑒定出13個(gè)化合物（占生品揮發(fā)性成分總量的94.60%），主要成分包括（Z，Z，Z）-9，12，15-十八烷三烯酸（26.13%）、十六酸乙酯（25.27%）、棕櫚油酸（10.84%）、亞油酸乙酯（10.67%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸甲酯（6.66%）、十五烷酸（5.11%）等。高烏頭炮制品飲片中共檢測出25個(gè)色譜峰，鑒定出18個(gè)化合物（占炮制品揮發(fā)性成分總量的82.40%），主要成分包括棕櫚油酸（18.95%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸甲酯（17.93%）、十六酸乙酯（11.94%）、（Z，Z，Z）-9，12，15-十八烷三烯酸（10.54%）、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸（5.51%）、（Z）-11-十六烷烯酸（5.30%）、亞油酸乙酯（4.31%）等。

炮制后新增7種成分，共鑒定出其中5種，分別為（-）-藍(lán)桉醇（3號峰）、2-甲基十四酸乙酯（6號峰）、6-甲基-4-苯基香豆素（18號峰）、β-谷甾醇（20號峰）、二十七烷（21號峰）;而炮制后未發(fā)現(xiàn)有消失的成分。

與炮制前（生品飲片）比較，炮制后飲片中有10種成分含量降低，分別為1、2、4、5、10、11、14、15、16、17號峰對應(yīng)的成分，分別降低了0.50、0.41、0.54、0.76、0.53、0.13、0.60、0.60、0.58、0.56倍。炮制后飲片中有8種成分含量增加，分別為7、8、9、12、13、22、24、25號峰對應(yīng)的成分，分別增加了0.75、1.04、0.50、1.69、1.41、6.16、1.04、5.27倍。

2.3 高烏頭炮制前后乙醇提取物石油醚萃取部位揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化規(guī)律推測

炮制過程中極可能由于輔料甘草汁的加入和高壓蒸制而發(fā)生多種復(fù)雜的化學(xué)成分變化及轉(zhuǎn)化[13-14]。本研究中，由于高烏頭炮制后各成分含量增加或減少，故難以根據(jù)炮制前后所含成分含量變化和結(jié)構(gòu)對比推測出多個(gè)成分的轉(zhuǎn)化規(guī)律。因此本研究僅根據(jù)亞油酸乙酯在炮制后含量顯著下降，推測出可能是通過酯水解轉(zhuǎn)化生成（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸，詳見圖2。

3 討論

高烏頭炮制后毒性降低可能與所含毒性的化學(xué)成分含量下降有關(guān)，但筆者查閱文獻(xiàn)后并未見有關(guān)十五烷酸、十六酸乙酯、（Z，Z，Z）-9，12，15-十八烷三烯酸和亞油酸乙酯等單一成分的毒性報(bào)道，由此筆者推測，高烏頭石油醚萃取部位的毒性可能是多種成分共同作用的結(jié)果;而新增及含量增加的成分可能為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，如棕櫚油酸可影響炎癥標(biāo)志物，如超敏C反應(yīng)蛋白和過氧化物酶體增殖物激活型受體代謝通路，對炎癥有一定的抑制作用，這可能是本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高烏頭經(jīng)炮制后抗炎活性增強(qiáng)的主要原因[15-16]。

脂肪酸及其酯類成分在醫(yī)療、食品、化工等多個(gè)領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用前景，亞油酸等脂肪酸類成分具有降低血脂及膽固醇水平、改善血液黏稠、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)等多種作用[17]。例如，（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸、十六烷酸具有抗微生物的作用，十六烷酸還可用作潤滑油和乳化劑[18-20];亞油酸乙酯、十五烷酸、香紫蘇醇、β-谷甾醇等具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌和調(diào)節(jié)糖代謝等活性[21-25]。因此，高烏頭乙醇提取物石油醚萃取部位的藥用價(jià)值有待進(jìn)一步研究與開發(fā)。

本研究將7批高烏頭藥材混合為1批后進(jìn)行研究，其主要原因?yàn)椋焊邽躅^屬于地方習(xí)用中藥材，基本屬于自產(chǎn)自用，考慮到不同批次高烏頭樣品可能會(huì)因采收時(shí)間、炮制操作、測定條件等因素造成石油醚萃取部位揮發(fā)性成分含量差異，故將多批藥材混合為1批后進(jìn)行加工炮制，使結(jié)果更具有代表性。另外，高烏頭產(chǎn)區(qū)除了甘肅外，在我國四川等省份亦有分布，不同地區(qū)的高烏頭所含成分亦會(huì)存在差異，故本研究結(jié)果只代表其產(chǎn)地（甘肅天祝藏族自治縣朱岔峽）高烏頭乙醇提取物石油醚萃取部位的品質(zhì)，可為后續(xù)不同產(chǎn)地高烏頭化學(xué)成分研究提供參考。

本研究中，高烏頭炮制前后乙醇提取物石油醚萃取部位的GC-MS對比結(jié)果顯示，炮制后該藥材中化學(xué)成分的變化明顯，這可能是由于甘草汁的加入和高壓蒸制的過程中發(fā)生了多種復(fù)雜的化學(xué)成分變化及轉(zhuǎn)化，如酒黃精經(jīng)高壓蒸制可使其多個(gè)成分的色譜峰面積增加[13];高烏頭經(jīng)甘草汁炮制可以提高其總生物堿含量[26];附子、烏頭用甘草汁制后，烏頭堿分解為烏頭次堿和烏頭原堿，毒性大大降低[27-28]。因此，為進(jìn)一步明確化學(xué)成分變化的根本原因和規(guī)律，本研究以甘草汁為陰性對照進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)變化的成分可能并不與炮制輔料甘草汁直接相關(guān)，而是高烏頭在炮制過程中經(jīng)復(fù)雜變化及轉(zhuǎn)化而來，但其具體變化規(guī)律有待深入研究。

綜上所述，經(jīng)炮制后，高烏頭乙醇提取物的石油醚萃取部位揮發(fā)性成分存在差異，炮制后新增多種成分，這可能與高烏頭在炮制過程中發(fā)生多種復(fù)雜的化學(xué)成分變化和轉(zhuǎn)化有關(guān)。

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（收稿日期：2020-09-28 修回日期：2021-03-29）

（編輯：陳 宏）