長鏈非編碼RNA MEG3對老年乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維化的診斷價值

趙紅英 王文浩 孫寧寧

肝纖維化是由多種病因導致的一種復雜的病理生理過程，是慢性肝病共同的病理特征。目前對于肝纖維化尚無特效治療方案，常難以治愈，可進一步發展為肝硬化。肝纖維化的病理特征為細胞外基質在竇周間隙沉積，而細胞外基質合成和降解失衡是導致患者出現肝纖維化的主要原因[1]。目前主要采用組織病理學、影像學及分子標志物檢查診斷肝纖維化，其中組織病理學為診斷肝纖維化的金標準，但其屬于創傷性檢查，患者接受度較低；影像學檢查雖具有簡便、快捷的優勢，但臨床缺乏特異性，無法進行早期診斷。目前已有一些生物標志物可用于診斷乙型肝炎肝硬化或肝纖維化，如金屬基質蛋白酶、Ⅳ型膠原等，但它們的敏感度和特異度較低[2-3]。因此，尋找新的具有高敏感度、高特異度的生物標志物對于早期診斷乙型肝炎肝硬化和纖維化具有重要的臨床價值。lncRNA是一種長鏈非編碼RNA，與人類的多種疾病有關，比如lncRNA母源性印記基因3(lncRNA MEG3)可抑制心臟纖維化[4]。研究表明，lncRNA MEG3通過SMO蛋白和miR-212途徑抑制肝星狀細胞的活化，可作為肝纖維化發生和發展過程中重要的生物標志物[5]。研究發現，在乙型肝炎合并肝纖維化的患者中，血清lncRNA MEG3水平低于健康對照組，其與肝纖維化程度呈負相關[6]。提示lncRNA MEG3是乙型肝炎肝纖維化的重要生物標志物。本研究通過分析乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維化患者中lncRNA MEG3的表達水平，以期明確lncRNA MEG3對乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月至2019年11月在滄州市中心醫院就診的60例老年乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維化患者，其中男性35例，女性25例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.52±5.41)歲，平均BMI為(21.32±6.46)kg/m2；其中肝硬化患者30例，肝纖維化患者30例，分別設為肝硬化組和肝纖維化組。肝硬化組中男性19例，女性11例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.31±5.70)歲，平均BMI為(21.54±6.84)kg/m2；肝纖維化組中男性16例，女性14例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.89±5.53)歲，平均BMI為(21.20±6.33)kg/m2。納入標準：(1)年齡≥60歲；(2)患者均符合《慢性乙型肝炎診斷標準(2015年版)》[7]中乙型肝炎的診斷標準；(3)簽署知情同意書；(4)無其他重大疾病，能夠配合此次研究。排除標準：(1)近1個月內接受過抗病毒藥物的治療；(2)具有器質性病變者；(3)伴有精神疾病或認知障礙者；(4)合并有器官衰竭、惡性腫瘤者；(5)臨床資料缺失者。另選擇同期在本院進行手術治療的30例老年肝血管瘤患者作為對照組，其中男性16例，女性14例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.78±5.23)歲，平均BMI為(22.04±5.28)kg/m2。肝硬化組、肝纖維化組和對照組在年齡、性別、BMI方面差異無統計學意義，具有可比性。本研究經滄州市中心醫院醫學倫理委員會批準(批件號2017018)。

1.2 研究方法

1.2.1 Ishak肝臟病變嚴重程度評分 肝纖維化和肝硬化患者進行超聲引導下經皮穿刺或組織學檢查，對照組患者術中獲取肝組織，使用4%甲醛固定所取得的肝組織。取部分組織進行石蠟包埋，5 μm厚度切片，然后行H-E染色。采用Ishak評分系統評估肝臟疾病分期，Ishak評分≥3分提示肝纖維化，Ishak評分≥5分提示肝硬化。

1.2.2 lncRNA MEG3表達水平檢測 取少量受試者的肝組織，采用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測肝組織lncRNA MEG3的表達水平。參照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，應用BIO-RAD反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后25 ℃ 5 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min滅活反轉錄酶活性，使用去離子水將cDNA稀釋10倍后置于-20 ℃保存。進行real-time qPCR操作，反應條件為95 ℃預變性1 min，之后94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s，共40個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt計算lncRNA MEG3的相對表達量[5]。引物由上海瀚杭生物科技有限公司設計并合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達 從液氮罐中取出肝組織凍存管，解凍后按照實驗室方法培養，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒測定細胞中總蛋白含量，以GAPDH為內參，采用蛋白質印跡法檢測肝組織中β-連環蛋白(β-catenin)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)的表達水平。以GAPDH為內參，應用Tanon 1600全自動數碼凝膠圖像分析系統拍照并進行半定量分析。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肝纖維化組和肝硬化組Ishak評分比較

肝纖維化組Ishak評分為(4.02±0.95)分，低于肝硬化組[(7.31±2.20)分]，差異有統計學意義(t=7.520，P<0.001)。

2.2 各組肝組織中lncRNA MEG3表達水平比較

對照組、肝纖維化組、肝硬化組lncRNA MEG3的表達水平中位數分別為17.96(11.84，20.50)、10.38(7.36，12.88)、5.27(4.18，6.68)。與對照組比較，肝纖維化組、肝硬化組lncRNA MEG3表達水平均降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；與肝纖維化組比較，肝硬化組lncRNA MEG3表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與肝纖維化組比較，#P<0.05

2.3 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達水平比較

與對照組比較，肝纖維化組、肝硬化組β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達水平均升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)；肝纖維化組與肝硬化組β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達水平比較

圖2 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表達水平

2.4 相關性分析

老年乙型肝炎患者肝組織中lncRNA MEG3表達水平與Ishak評分呈負相關，即lncRNA MEG3表達水平越低，肝臟組織病變可能越嚴重。見表3。

表3 lncRNA MEG3、β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達與Ishak評分相關性

2.5 lncRNA MEG3對肝纖維化和肝硬化的診斷價值

lncRNA MEG3診斷肝纖維化的ROC曲線下面積(AUC)為0.930，最佳截斷值為13.12，敏感度為86.7%，特異度為93.3%(見圖3A)。lncRNA MEG3診斷肝硬化的ROC AUC為0.926，最佳截斷值為7.32，敏感度為96.3%、特異度為76.8%(見圖3B)。

圖3 lncRNA MEG3診斷肝纖維化和肝硬化的ROC曲線 A 肝纖維化 B 肝硬化

3 討論

乙型肝炎是一種危害性較大的傳染性疾病，據相關數據統計，全世界約20億人感染HBV，其中約4億人屬于慢性HBV感染者，約占總數的6%[8]。乙型肝炎患者若不及時進行積極治療，可逐漸發展為肝硬化，甚至肝細胞癌[9]。機體感染HBV后，病毒在體內不斷復制，啟動自身免疫應答系統清除病毒時，亦可導致肝細胞損傷，且可能進一步導致肝纖維化。肝活組織檢查是診斷肝纖維化的金標準，但此種診斷方式為有創性檢查，且價格昂貴，患者不易接受[10]。因此，探尋敏感度和特異度均較高的檢查方式具有重要的臨床意義。

lncRNA作為非編碼RNA的重要組成部分，可參與腫瘤生長、轉移及侵襲等多種生物學行為。王冰等[11]研究顯示，lncRNA MEG3可通過靶向Rac1信號通路，在宮頸癌細胞增殖、遷移過程中發揮抑制作用。研究表明，有多個lncRNA分子被證實可通過多種方式參與肝硬化的形成過程[12]。lncRNA MEG3首次被發現于小鼠大腦中，其表達水平降低與肝癌細胞的增殖和凋亡有關[13]。Yu等[5]研究報道，慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者中lncRNA MEG3的表達水平明顯低于健康對照組。本研究檢測了乙型肝炎并發肝纖維化和肝硬化患者肝組織中lncRNA MEG3的表達水平，并與對照組進行比較，結果發現對照組lncRNA MEG3的表達水平最高，其次為肝纖維化組，而肝硬化組最低，與Yu等[5]的研究結論相符，提示肝組織中lncRNA MEG3表達水平降低可能與老年乙型肝炎患者并發肝纖維化和肝硬化有一定關聯。

Caspase-3與細胞增殖及凋亡具有密切的聯系，其屬于Caspase家族，是一種效應蛋白，研究顯示多種信號通路凋亡期間可能激活Caspase-3，從而促使肝星狀細胞增殖與凋亡[14]。本研究發現，乙型肝炎肝硬化和肝纖維患者肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達水平均較對照組升高，提示肝組織β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達水平升高參與了老年乙型肝炎患者肝纖維化和肝硬化的發生。Pearson檢驗分析發現，老年乙型肝炎患者肝組織中lncRNA MEG3表達水平與Ishak評分呈負相關，提示老年乙型肝炎患者lncRNA MEG3表達水平越低，肝臟組織病變可能越嚴重。β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3與Ishak評分無明顯相關性，此結果需增加樣本量進一步分析。此外，ROC曲線分析顯示，lncRNA MEG3可作為診斷老年乙型肝炎患者肝纖維化和肝硬化的指標，且診斷肝纖維化的特異度較高，診斷肝硬化的敏感度相對較高，具有一定推廣價值。

綜上所述，lncRNA MEG3在老年乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維化患者中的表達水平較高，可作為此類患者的早期血清生物標志物，在診斷乙型肝炎并發肝硬化和肝纖維等方面具有重要價值，并可用于評估患者的病情嚴重程度，值得在臨床推廣應用。