中藥金銀花分子真偽鑒別方法研究進展

李雪瑩 山東中醫藥高等專科學校

金銀花因所具疏風散熱、清熱解毒功效而于臨床常用，是傳統方劑銀翹散的主要成分。其在《中國藥典》有所收載，多項現代藥理實驗已證實，其具抗心肌缺血、抗炎、神經保護、抗病毒、調節免疫等系列作用[1]。就金銀花特性而言，其自忍冬科植物忍冬的初開花或干燥花蕾為來源。在藥典（2015版）中，已明確將華南忍冬、近緣種紅腺忍冬、黃褐毛忍冬、灰氈毛忍冬列為山銀花。經調查在既往，將金銀花和山銀花均歸為金銀花范疇進行使用，因此金銀花誤用現象一直較為嚴重。由于形態上的相似性，市場上時常出現以次充好的情況，比如以山銀花藥材充當金銀花，引發市場混亂，故提高檢測力度意義顯著。但在對中藥金銀花分子真偽進行鑒別時，存在較大難度，分析原因，首先，因對于金銀花種及變種而言，在化學成分和形態學方面均具高度相似性，采取傳統手段進行鑒別時，較較大難度；另一方面，金銀花有較廣的引種栽培面積，各產地在生態環境方面存在較大差異，產地不同，化學成分和形態也表現有較大的差別的情況，應用化學、形態學、甚至藥理方案展開鑒別，在結論上易存有爭議。因此，為了鑒定和評價金銀花和各品種山銀花性狀的差異，品質的差異及不同種質之間的親緣關系，急需建立科學性強、使用方便的新種質鑒別方法。

分子標記技術可劃分為如下四類：其一，基于分子雜交技術，如RELP，因實驗操作的繁瑣性及時效性較差、成本較高等問題而應用受限；其二，基于PCR技術，如PAPD、ISSR，可謂近年呈最為迅猛發展、最廣應用范圍的分子標記技術；其三，基于DNA序列分析，如ITS，對藥用植物鑒別較為有利，與基于PCR技術的分子標記技術一樣獲得了較快發展[2]；其四，基于限制性酶切與PCR技術。以下即針對最為廣泛的金銀花藥材鑒定所采用分析標記技術予以列舉與分析。

一、ITS序列測序技術

現行分子標記中，ITS序列的應用表現為最為頻繁的情況，作為極具特色的內轉錄間隔區，包括ITS1、ITS2兩部分，觀測其長度均在300bp以內，而對于大部分被子植物而言，長度均在700bp以下，極為便宜開展分子操作。對于易于混淆中藥材及其本身的鑒別，分子鑒別技術如DNA條形碼等正異軍突起，獲廣泛應用[3]。馮圖等[4]對“金銀花”及易混藥材的鑒別研究中，以不同序列DNA條形碼予之以檢測，得出matK、ITS、trnl-tmF序列可達到有效鑒別目的，可視為候選。劉震等[5]則取通用序列實施對忍冬科植物DNA條形碼的篩選工作，得出ITS2可判斷為候選，psbA-trnH序列可為其補充，但有一點需注意，ITS2序列并不能對忍冬屬物種予以完全鑒定出，同時亦不能精準區分灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬。Wang 等[6]在結合化學活性物質、形態學特征的基礎之上，采用ITS序列對“金銀花”及近緣種進行鑒別。崔志偉等[7]則通過psbA-trnH、ITS2序列，成功實現了來自不同地區（河南、山東、河北、山西）不同種質“金銀花”的鑒別工作。王沖之等[8]經縝密思索，經對退火溫度提高、添加改性劑等途徑，使“金銀花”rDNAITS區擴增效率得以較大幅度提升，推動了植物來源DNA模版PRC擴增問題的有效解決。nrDNA非轉錄間區，即ITS區，在近年的植物藥材分子鑒定中已獲越來越廣泛的應用[9、10]。而伴隨著分子標記技術日新月異的發展進程，經ITS序列對中草藥實施分子鑒定的相關技術日臻成熟，漸趨用于越來越多的中草藥鑒定，以其差異性完成分相關分析與系統的鑒定事宜。

二、葉綠體基因區段規范性測序技術分析

葉綠體基因對于中草藥分子鑒定擁有舉重若輕的作用，其作為重要的分子標記，所具特點及優勢分析如下：其一，cpDNA呈結構簡單、分子量小以及多拷貝特點，對葉綠體基因組可行有效分析。其二，相對具有較多重復序列核基因或頻繁重排線粒體基因組來講，葉綠體基因較為保守，進化速率僅為核基因1/3，具體為每年每個位點平均值約為0.2-1.0×10-9，以于堿基缺失、點突變或是插入為主要突變類型。另外，據觀察，相較于編碼區，葉綠體非編碼區DNA呈現出更快的進化速率，此特點使之可更加適應與滿足不同分類水平系統演化需要。其三，具單性遺傳特性，不必依賴于其他數據即可對分子系統樹予以構建，即具獨立進化路線，可依托于系統與歷史發育對生物多樣性進行解釋，并提供精準且可靠信息。經此，對葉綠體基因區段相關測序技術展開構建操作，可為中草藥的有效分析鑒定打下良好基礎。

三、隨機擴增多態性DNA（Rando m Amplified Polymorphism DNA，RAPD）

PAPD技術，其本質即分析DNA經PRC擴增后所賦予的多態性的變化，繼而進行精準有效的對所檢測目標生物體內在基因排布與外在性狀表現的判斷[11]。王文炳[12]以山東省平邑縣為地理范圍，以3個品系的金銀花遺傳信息為檢測標的，經檢測，新種質所表現出的遺傳距離親緣關系，相較毛花品系，與雞爪花系更近。王一斐等[13]則以膠東地區為地理范圍，以31個金銀花種質為檢測標的，經PDPD法檢測，探討不同種質間所表現出的遺傳關系，結果示，“金銀花”種源不同，也具遺傳多樣性特征，且遺傳關系與地理分布具相關性。此外，因PAPD技術靈敏度高、操作簡單，且成本低，進而使得相關的中草藥鑒定研究報道較多。但在穩定性方面，該技術仍存在欠缺，具有較低的可重復性，需與其他細胞學、分子生物學等聯合使用，以使結果的可信度增強。

四、簡單重復序列間區（ISSR）特征

對于ISSR分子標記，其常用引物即為錨定微衛星DNA，屬分布于SSR序列中在3’或 5’端區域的隨機核苷酸，錨定引物可致其互補間隔呈較近顯示的重復序列間分布的DNA片段表現為PCR擴增狀態。同時，由此擴增的Inter-SSR處多個條帶的分辨與鑒定可經由瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳完成。該技術有機結合了PAPD、SSR的優點，同時可對更多基因組DNA信息予以提供。王曉明等[14]以該技術對來源于山東、河南與湖南三地的22個金銀花種質實施遺傳多樣性分析，結果所示，ISSR技術可為金銀花種質的相關鑒別工作，并促進種質資源高效利，同時，也可就理論依據向分類操作提供，即可對其遺傳多樣性予以有效分析。韓琳娜等[15]選取三大道地產區生長的27個金銀花植質資源行ISSR遺傳多樣性分析，結果示，其多態性比率經測定得出的結果為88.4%，遺傳的相似系數介于0.50～0.90之間，表明地域不同，金銀花在遺傳上表現為較大差異，可作為鑒別要點，以促進資源合理應用。該技術近年來廣泛用于種質資源遺傳多樣性研究、種質鑒定中，同時對于中草藥鑒定亦具廣闊前景。

因高效、精確及可靠性，分子標記獲迅速發展。當前階段下，該技術已在分析系統學、植物分類、系譜分析、遺傳多樣性、基因型標記以及種質指紋圖譜繪制等諸多領域獲得廣泛應用與發展，并在中草藥鑒定中另辟蹊徑，提供了新的思路與方向。