新疆薰衣草精油抗氧化活性成分的組效關系研究

陳萍 劉兵 符繼紅

摘 要 目的：探討薰衣草精油抗氧化活性成分的組效關系。方法：采用1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）自由基清除法評價薰衣草精油的抗氧化活性;采用氣質聯用技術（GC-MS）結合保留指數對薰衣草精油成分進行定性分析;采用主成分分析、偏最小二乘法分析薰衣草精油化學成分與抗氧化活性的關系，以變量投影重要性（VIP）>1篩選對DPPH自由基消除有較大貢獻的成分。結果：3個不同品種共9批薰衣草精油的平均半抑制濃度（IC50）為4.82～9.88 mg/mL，法國藍、H-701、Xinxun-4精油樣品的平均IC50分別為6.66～8.58、4.82～7.73、9.55～9.88 mg/mL;從中共鑒定出40個化學成分。PCA分析結果顯示，前二個主成分的累積方差貢獻率為81.8%;9批樣品被分為3個區域，不同品種各歸為一類;法國藍薰衣草精油的特征變量成分為峰32對應的乙酸薰衣草酯、峰9對應的反式-β-羅勒烯;H-701藍薰衣草精油的特征變量成分為峰16對應的芳樟醇、峰30對應的乙酸芳樟酯和峰21對應的萜品烯-4-醇;Xinxun-4藍薰衣草精油的特征變量成分為峰8對應的桉樹腦、峰18對應的樟腦和峰20對應的2-茨醇。薰衣草精油中對抗氧化活性貢獻較大的成分為峰16對應的芳樟醇（VIP值為2.940 0）、峰21對應的萜品烯-4-醇（VIP值為2.863 1）、峰35對應的石竹烯（VIP值為2.570 8）、峰8對應的桉樹腦（VIP值為2.115 8）。結論：薰衣草精油具有一定的抗氧化活性，H-701精油樣品的抗氧化活性較強;峰16對應的芳樟醇可能是薰衣草精油消除DPPH自由基貢獻最大的成分。

關鍵詞 薰衣草精油;抗氧化活性;氣質聯用技術;組效關系

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the composition-activity relationship of the antioxidant active component in essential oil of Lavandula angustifolia from Xinjiang. METHODS： Antioxidant activity of essential oil of L. angustifolia was evaluated with 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radicals scavenging method. GC-MS combined with retention index were adopted to qualitatively analyze the compounds. The relationship of chemical components with antioxidant activity of essential oil of ? ? ? ? ? ?L. angustifolia was analyzed by principal component analysis （PCA） and partial least squares analyses （PLS）. The variable importance in projection （VIP>1） was used to screen the components which had great contribution to the elimination of DPPH free radical. RESULTS： The IC50 values of essential oil in 9 batches of L. angustifolia from 3 different varieties was 4.82-9.88 mg/mL， IC50 of France blue was 6.66-8.58 mg/mL， IC50 of H-701 and Xinxun-4 were 4.82-7.73 mg/mL and 9.55-9.88 mg/mL， respectively. A total of 40 chemical components were identified of essentil oil in 9 batches of L. angustifolia. Results of PCA analysis showed that accumulative variance contribution rate of former 2 main components was 81.8%; 9 batches of samples were divided into 3 regions， and different varieties were classified into one category; the characteristic variable components of the essential oil of French blue samples were lavandulyl acetate corresponding to peak 32 and trans-β-ocimene corresponding to peak 9; the characteristic variable components of the essential oil of H-701 samples were linalool corresponding to peak 16， linalyl acetate corresponding to peak 30 and terpinen-4-ol corresponding to peak 21; the characteristic variable components of the essential oil of Xinxun-4 samples were eucalyptol corresponding to peak 8， camphor corresponding to peak 18 and 2-borneol corresponding to peak 20. The compound with the greatest antioxidant activity was linalool corresponding to peak 16 （VIP=2.940 0）， followed by terpenein-4-ol corresponding to peak 21 （VIP=2.863 1）， caryophyllene corresponding to peak 35 （VIP=2.570 8） and eucalyptol corresponding to peak 8 （VIP=2.115 8）. ?CONCLUSIONS： The essential oil of L. angustifolia has certain antioxidant activity， and H-701 sample has higher antioxidant activity. Linalool corresponding to peak 16 is the most important component of essential oil of L. angustifolia in eliminating DPPH free radical.

KEYWORDS ? Essential oil of Lavandula angustifolia; Antioxidant activity; GC-MS; Composition-activity relationship

薰衣草Lavandula angustifolia Mill.為唇形科薰衣草屬植物。新疆伊犁是我國薰衣草的主要種植地區，與法國的普羅旺斯、日本北海道的富良野同為世界三大薰衣草基地[1]。維吾爾醫學認為，薰衣草能消散寒氣、燥濕止痛，可用于治療胸腹脹滿、感冒咳喘、頭暈頭痛、心悸氣短等癥[2]。薰衣草精油為薰衣草花穗的提取物，具有抗焦慮、鎮靜催眠等作用，還可用于治療皮炎和濕疹等皮膚病[3-5]。薰衣草精油是一種潛在的廣譜抗菌物質，也是一種抗氧化劑，其在較低的濃度下即可顯示出較強的抗氧化能力[6-9]。有研究表明，腫瘤、衰老的發生多與人體內過量自由基的產生有關，抗氧化劑可以清除機體產生的自由基，因此其相關研究越來越受到學者的重視[10]。由于薰衣草精油所含的化學成分復雜，主要包括芳樟醇、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、萜品烯-4-醇和羅勒烯等多種成分[11]，加之其現有相關研究主要集中在化學成分的定性和定量分析上，且藥效學研究僅限于抗氧化活性的總體評價，尚未有研究對薰衣草精油中具體的抗氧化活性組分進行識別及鑒定。

中藥組效關系為化學組成與藥效的相關性研究提供了良好的解決思路。采用化學計量學方法構建中藥化學組分與活性之間的數學模型，可實現對活性成分的辨識[12-13]。氣質聯用技術（GC-MS）具有分離效率高、重現性好、定性能力強等特點，特別適合于精油成分的分析[14]。基于此，本研究采用GC-MS技術分析了薰衣草精油中的化學成分，并以 1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）自由基清除能力來初步評價其抗氧化活性;同時，采用組效學方法構建薰衣草精油GC-MS組分峰與抗氧化活性的數學模型，以識別其具有抗氧化活性的化學成分，旨在為相關藥物的研究與開發提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括7890B GC-5977A MSD型GC-MS聯用儀（美國Agilent公司）、UV-3600型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）、BS124S AG型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

DPPH（色譜純，批號G1712053）購自阿拉丁生化科技股份有限公司;正構烷烴C5～C24標準品（色譜純，批號R11391，純度均大于99%）購自百靈威科技有限公司;甲醇、無水硫酸鈉均為分析純，水為蒸餾水。

3個品種（法國藍、H-701、Xinxun-4）共9批薰衣草樣品均于2017年7月采自新疆伊犁地區，經新疆大學生命科學與技術學院謝麗瓊教授鑒定均為唇形科薰衣草屬植物薰衣草L. angustifolia Mill.的花穗。9批薰衣草樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 薰衣草精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取薰衣草精油。取薰衣草花穗樣品40 g，加水560 mL，提取2 h，待其靜置分層后，收集油層，用無水硫酸鈉干燥，密封于2 mL的琥珀色樣品瓶中，置于4 ℃冷藏，備用（9批薰衣草精油分別編號為a1～a4、b1～b3、c1～c2）。

2.2 抗氧化作用考察

采用DPPH自由基清除法評價薰衣草精油的抗氧化活性[15]。取DPPH 2.4 mg，加入甲醇10 mL，溶解，混勻;取上述溶液1 mL，加入甲醇45 mL稀釋，制成DPPH甲醇溶液，置于4 ℃下保存，備用。取上述DPPH甲醇溶液2 mL，分別加入“2.1”項下不同體積（10、20、30、50、100 μL）的薰衣草精油，用甲醇定容至4 mL，制成不同質量濃度（2.45、4.92、7.45、12.25、25.5 mg/mL）的薰衣草精油樣品，待其在室溫陰暗處反應1 h，使用紫外分光光度計于515 nm波長處測定上述不同質量濃度薰衣草精油樣品的吸光度（A），并計算樣品對DPPH自由基的清除率：清除率（%）=[A0-A1

A0] ×100%。式中，A0表示DPPH甲醇溶液的吸光度，A1表示在陰暗處反應1 h后溶液的吸光度[16]。采用Excel 2016 軟件根據清除率繪制標準曲線，計算薰衣草精油清除50%DPPH自由基時所對應的半數清除濃度（IC50），所得IC50值越小，表明薰衣草精油清除自由基的能力越強[17]。上述實驗重復3次，結果見表2。

由表2可知，薰衣草精油的平均IC50值為4.82～9.88 mg/mL;其中，法國藍精油樣品的平均IC50值為6.66～8.58 mg/mL，H-701精油樣品的平均IC50值為4.82～7.73 mg/mL，Xinxun-4精油樣品的平均IC50值為9.55～9.88 mg/mL，表示薰衣草精油具有一定的自由基清除能力，且以編號為b2的精油樣品的抗氧化活性較強。

2.3 GC-MS分析條件

2.3.1 GC條件 以DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）為色譜柱，程序升溫（起始溫度50 ℃并保持20 min，以2 ℃/min升到120 ℃后再以10 ℃/min升到250 ℃），載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣量為0.2 μL，分流比為60 ∶ 1，進樣口溫度為250 ℃。

2.3.2 MS條件 離子源為電子轟擊離子源（EI）;電子轟擊能量為70 eV;離子源溫度為230 ℃;接口溫度為250 ℃;掃描方式為全掃描，掃描范圍為m/z 30～500。

2.4 保留指數的測定

采用“2.2”項下GC-MS分析條件測定正構烷烴C5～C24標準品的保留時間，并計算薰衣草精油中各化合物的保留指數（RI）：RIX=100n+100×[tR（X）-tR（n）tR（n+1）-tR（n）] 。式中，RIX表示化合物x的烷烴保留指數，tR（X）、tR（n）、tR（n+1）分別表示化合物x、第n個碳正構烷烴和第n+1個碳正構烷烴的保留時間[18]。

2.5 數據處理與分析

取 “2.1”項下9批薰衣草精油各適量，按“2.2.1”“2.2.2”項下GC-MS條件進樣分析，得總離子流圖（圖1）。通過檢索NIST 2017譜庫（https：//webbook.nist.gov/chemistry/），將各化學成分的保留指數與NIST 2017譜庫收錄成分的保留指數進行對比，并結合相似度（相似度>85%）對薰衣草精油的化學成分進行準確定性;采用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對面積百分含量，結果見表3（表中，RIa表示計算的保留指數，RIb表示譜庫中的保留指數，“-”表示未檢測出）。結果，經過檢索和對比，從9批薰衣草精油中共鑒定出40個化學成分。其中，法國藍（編號a1～a4）的主要成分分別為峰16、30、32、23、9對應的芳樟醇、乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯、α-萜品醇、反式-β-羅勒烯;H-701（編號b1～b3）的主要成分分別為峰16、30、23、21、32對應的芳樟醇、乙酸芳樟酯、α-萜品醇、萜品烯-4-醇、乙酸薰衣草酯;Xinxun-4（編號c1～c2）的主要成分分別為峰16、8、18、30、20對應的芳樟醇、桉樹腦、樟腦、乙酸芳樟酯、2-茨醇。

2.6 主成分分析

主成分分析（PCA）是一種非監督的學習方法，是從原始變量數據中導出少數幾個互不相關的主成分（PCs），使PCs盡量完整地保留原有數據的信息，以此估計不同變量之間的關系[19-20]。采用Simca-P14軟件以9批薰衣草精油中40個色譜峰的相對面積百分含量進行PCA。結果，第一主成分累積方差貢獻率為63.1%，第二主成分累積方差貢獻率為18.7%，累積方差貢獻率為81.8%，故前二個主成分可以代表原數據的主要信息，詳見圖2。其中，圖2A可直觀地給出各薰衣草精油樣本在空間上的位置分布，可見3個不同品種、9批薰衣草精油樣品被分為3個區域，且同一個品種薰衣草精油樣品的位置相對集中，證明同一個品種的化學成分相似度較高。由圖2B可以看出，離中心原點較遠的化合物是區分3個不同品種薰衣草精油樣品的特征化合物。法國藍精油（編號a1～a4）的特征變量成分分別為峰32、9對應的乙酸薰衣草酯和反式-β-羅勒烯，H-701精油（編號b1～b3）的特征變量成分分別為峰16、30、21對應的成分芳樟醇、乙酸芳樟酯和萜品烯-4-醇，Xinxun-4精油（編號c1～c2）的特征變量成分分別為峰8、18、20對應的桉樹腦、樟腦和2-茨醇。

2.7 偏最小二乘法分析

偏最小二乘法（PLS）分析可用一個線性模型來描述獨立變量Y（抗氧化活性值）與預測變量組X（化學成分）之間的關系，可以較好地解決許多以往用普通多元回歸無法解決的問題，使數據分析更準確可靠[21]。采用Simca- P14軟件進行PLS分析。以薰衣草精油中化學成分的相對面積百分含量為X變量、抗氧化活性值IC50為Y變量建立PLS回歸模型，并通過PLS回歸模型得到變量投影重要性（VIP）值，通過描述變量的貢獻程度來篩選變量組分。VIP>1的變量被認為是對消除DPPH自由基有較大貢獻的化學成分[22]。結果，對抗氧化活性有較大貢獻的成分分別為峰16、21、35、8、20對應的芳樟醇（VIP值為2.940 0）、萜品烯-4-醇（VIP值為2.863 1）、石竹烯（VIP值為2.570 8）、桉樹腦（VIP值為2.115 8）、2-茨醇（VIP值為1.329 8），詳見圖3[圖3B中，在繪制VIP圖時，由于其余3個化合物的VIP值過小（小于圖中最后一個化合物1-辛烯-3醇的VIP值0.089 4），對模型解釋程度極低，故圖中只有37個化合物]。

3 討論

有研究表明，許多慢性病的發生和發展與機體的氧化、代謝和抗氧化能力密切相關[23]。人體在利用氧的過程中會因自然代謝或環境污染、食品污染等因素產生一些活性氧和自由基，當機體內環境中的“氧化和抗氧化”平衡被打破時，就會出現各種組織損傷并誘發疾病[24]。因此，為預防氧化對人體的不良影響，一些人工合成的抗氧化劑被研發和使用。但人工合成的抗氧化劑具有一定的生物毒性和致癌效應[25]，故臨床對安全、無毒副作用的新型抗氧化劑的需求較為迫切。通過深入研究天然產物，從中尋找無毒副作用的抗氧化劑，并將其應用到食品、藥品、化妝品等行業中將有助于提高人們的生活質量[24]。本研究基于組效關系探討了薰衣草精油化學成分和抗氧化活性的關系，采用化學模式識別技術分析并提取了薰衣草精油中的抗氧化活性成分的特征信息，有助于揭示薰衣草精油抗氧化活性的藥效物質基礎，并對其相關產品的深入研發提供科學依據。

本研究采用GC-MS法分析了新疆3個品種9批薰衣草精油，以GC-MS結合RI對化學成分進行定性。結果表明，從3個品種薰衣草精油中共鑒定出40個化學成分，且其化學成分在組成和含量上存在差異。其中，峰16、30對應的芳樟醇和乙酸芳樟酯是法國藍和H-701精油樣品中含量較高的成分（兩者總含量>50%）;峰16、8對應的芳樟醇和桉樹腦是Xinxun-4精油樣品中含量較高的成分（含量為18.88%～30.96%）。抗氧化活性實驗結果表明，薰衣草精油具有一定的抗氧化活性，對DPPH自由基具有較好的清除能力，其中H-701精油樣品的抗氧化活性較強。PCA結果顯示，3個不同品種9批薰衣草精油樣品根據品種的不同被準確分為3個區域，法國藍位于PC2的正半軸上，H-701位于PC2的負半軸上，Xinxun-4位于PC1的正軸上。法國藍薰衣草精油的特征變量組分為峰32、9對應的乙酸薰衣草酯和反式-β-羅勒烯;H-701的特征變量組分為峰16、30、21對應的芳樟醇、乙酸芳樟酯和萜品烯-4-醇;Xinxun-4的特征變量組分為峰8、18、20對應的桉樹腦、樟腦和2-茨醇。PLS分析結果顯示，對薰衣草精油抗氧化活性貢獻最大的成分為峰16對應的芳樟醇，其次分別為峰21、35、8、20對應的萜品烯-4-醇、石竹烯、桉樹腦、2-茨醇等。其中，峰16對應的芳樟醇是對薰衣草精油消除DPPH自由基貢獻最大的成分，與文獻報道結果一致[26-28]。

綜上所述，薰衣草精油具有一定的抗氧化活性，H-701樣品的抗氧化活性較強;峰 16對應的芳樟醇可能是對薰衣草精油消除DPPH自由基貢獻最大的成分。

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（收稿日期：2021-01-27 修回日期：2021-05-11）

（編輯：陳 宏）