管花肉蓯蓉多糖水提物的分離及免疫活性研究

艾拉旦·麥麥提艾力 李洋 姚軍 袁潔

摘 要 目的：分離管花肉蓯蓉多糖水提物，考察分離物的體外免疫活性。方法：采用AB-8大孔吸附樹脂法對管花肉蓯蓉多糖進行脫色，以多糖保留率和多糖脫色率為指標進行綜合評分，以吸附速率、脫色時間、上樣質量濃度為因素，采用正交實驗優化脫色工藝并驗證。采用DEAE-650M離子交換柱層析柱對脫色后的管花肉蓯蓉多糖水提物進行分離。采用CCK-8法檢測不用質量濃度（6.25～100 μg/mL）分離前、后各種多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖率的影響，采用Griess法和酶聯免疫吸附測定法檢測低、中、高質量濃度（12.5、25、50 μg/mL）分離前、后各種多糖對脂多糖（LPS）誘導RAW264.7細胞一氧化氮（NO）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）釋放量的影響。結果：AB-8大孔吸附樹脂的最優脫色工藝為吸附流速1.2 BV/h，脫色時間9 h，上樣質量濃度25 mg/mL;3次驗證實驗的綜合評分分別為63.43%、63.29%、63.34%，平均值為63.35%（RSD=0.11%，n=3）。從管花肉蓯蓉多糖水提物中分離出1種中性多糖（CTZ）和5種酸性多糖（CT1、CT2、CT3、CT4、CT5），含量分別為299.2、168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。與對照組比較，6.25～100 μg/mL的CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5和6.25 μg/mL的CTC（即分離前的多糖）均可顯著增加RAW264.7細胞的增殖率（P<0.05），6.25～100 μg/mL的CT1、CT3和50 μg/mL的CTC均可顯著降低RAW264.7細胞的增殖率（P<0.05）。與LPS組比較，低、中、高質量濃度CTC、CT2、CT3、CT5組和低質量濃度CTZ組細胞的NO釋放量均顯著降低（P<0.05），高質量濃度CT1、CT4組細胞的NO釋放量均顯著升高（P<0.05）;低、中、高質量濃度各組細胞的IL-6（高質量濃度CT1組和低質量濃度CT5組除外）、TNF-α釋放量（中質量濃度CT1組除外）均顯著降低（P<0.05）。結論：本研究所優化的大孔吸附樹脂脫色工藝穩定、可行;管花肉蓯蓉多糖水提物中可分離出1種中性多糖、5種酸性多糖，其中酸性多糖CT2的免疫活性較強。

關鍵詞 管花肉蓯蓉多糖;脫色;分離;免疫活性

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To isolate the water extract of polysaccharide from Cistanche tubulosa，and to investigate their immunocompetence in vitro. METHODS： AB-8 macroporous adsorption resin was used to decolorize C. tubulosa polysaccharide. The decolorization process was optimized by orthogonal test with retention rate and decolorization rate of polysaccharide as comprehensive score， and using adsorption rate， decolorization time， sample concentration as factors. The verification tests were conducted. DEAE-650M ion exchange column was used to separate the water extract of decolorized C. tubulosa polysaccharide. CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentration of polysaccharide （6.25-100 μg/mL） before and after isolation on the proliferation rate of mice macrophage RAW264.7. Griess method and ELISA assay were adopted to detect the effects of low， medium and high concentration of polysaccharide （12.5， 25， 50 μg/mL） on the release of NO， IL-6 and TNF-α in LPS-induced RAW264.7 cells. RESULTS： In the optimal decolorization process of AB-8 macroporous adsorption resin， the adsorption flow rate was 1.2 BV/h， the decolorization time was 9 h， and sample concentration was 25 mg/mL. The comprehensive scores of 3 times of verification tests were 63.43%， 63.29% and 63.34%， respectively， with an average of 63.35% （RSD=0.11%， n=3）. One neutral polysaccharide （CTZ） and 5 acid polysaccharides （CT1， CT2， CT3， CT4， CT5） were isolated from the polysaccharide of C. cistanche， the contents were 299.2， 168.0， 123.2， 121.6， 54.4， 11.2 mg/g. Compared with control group， 6.25-100 μg/mL CTZ （except for 6.25 μg/mL）， CT2， CT4， CT5 and 6.25 μg/mL CTC （the polysaccharide before seperation） could significantly increase the proliferation rate of RAW264.7 cells （P<0.05）， while 6.25-100 μg/mL CT1， CT3 and 50 μg/mL CTC could decrease te proliferation rate of RAW264.7 cells （P<0.05）. Compared with LPS group， the release of NO were decreased significantly in low， medium and high concentration groups of CTC， CT2， CT3 and CT5， CTZ low concentration group （P<0.05）， while were increased significantly in high concentration groups of CT1 and CT4 （P<0.05）. The release of IL-6 （except for CT1 high concentration group and CT5 low concentration group） and TNF-α （except for CT1 medium concentration group） were decreased significantly in low， medium and high concentration groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： The optimized decolorization technology of macroporous adsorption resin is stable and feasible in the study. One neutral polysaccharide and 5 acidic polysaccharides can be isolated from water extract of C. tubulosa polysaccharides， among which CT2 polysaccharide has stronger anti-inflammatory ability.

KEYWORDS ? Cistanche tubulosa polysaccharide; Decolorization; Separation; Immunocompetence

管花肉蓯蓉為列當科管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質莖?，F代研究表明，管花肉蓯蓉含有苯乙醇苷類、環烯醚萜苷類、木脂素類、多糖類、生物堿類等多種生物活性物質，具有壯陽、通便、保肝、抗衰老、抗疲勞、增強免疫力及益智等功效[1-4]，可用于臨床治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥[5]。

管花肉蓯蓉多糖水提物呈棕黃色，本課題組前期實驗發現，該水提物中除含管花肉蓯蓉多糖外，還包含水溶性色素、蛋白質等非目標成分，這給多糖的分離純化、生物活性研究等造成了很大的困難。傳統的有機溶劑脫色處理會破壞粗提物中目標成分的化學結構，降低后者的藥理活性，并引入對人體有害的成分[6]。大孔吸附樹脂是中藥提取物中多糖脫色的常用材料，是一種性價比較高的高分子吸附材料，其物理、化學性質穩定，利用其對色素成分的選擇吸附和篩分性能，可針對性地去除中藥提取物中的色素，加之其可通過酸洗堿洗的方式進行再生，因而得以廣泛應用[7]。本研究擬利用大孔吸附樹脂對管花肉蓯蓉多糖水提物進行脫色處理，并采用正交實驗對脫色條件進行優化;提取物經脫色處理后，依據多糖所攜帶基團性質的不同，擬用離子交換柱層析的方法，進一步分離管花肉蓯蓉多糖中的中性、酸性多糖組分。

已有研究表明，植物多糖具有免疫調節作用，是天然的免疫調節劑，可以激活補體系統和T/B淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞等免疫細胞，同時亦可促進多種細胞因子的釋放，并促進抗體的生成等[8-11]。脂多糖（LPS）可激活巨噬細胞的炎癥信號通路，誘導一氧化氮（NO）和諸如白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎細胞因子誘導的合成及釋放，從而引發機體一系列的炎癥反應[12]。本研究擬建立LPS誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，從管花肉蓯蓉多糖對巨噬細胞增殖、炎癥因子分泌和NO產生等方面的影響入手，初步評價其對機體免疫活性的影響，旨在為深入研究管花肉蓯蓉多糖抗炎活性物質基礎以及開發其多糖資源提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）、Multiskan Go型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Herocell 180型CO2培養箱（上海潤度生物科技有限公司）、AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、OSB-2100EYELA型油浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）、N-1001EYELA型旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）、THZ-100型恒溫搖床（上海一恒儀器有限公司）、3-18K型離心機（德國Sartorius AG公司）、IX71-12FL/PH型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

管花肉蓯蓉多糖水提物（批號20180201，每克多糖相當于17.36 g管花肉蓯蓉）由新疆和田帝辰醫藥生物科技有限公司惠贈，樣品于密封、陰涼、干燥處存放;蒽酮（批號20190120）購自上?？曝S實業有限責任公司;無水葡萄糖（分析純，批號：20181115）購自天津市科密歐化學試劑有限公司;DEAE-650M離子交換填料（粒徑40～90 μm）購自日本Tosoh公司;AB-8大孔吸附樹脂（粒徑3.3～1.25 mm）購自天津市光復精細化工研究所;胎牛血清（FBS，批號1966173C）購自美國Gibco公司;DMEM高糖培養基（批號AF29562465）、鏈霉素+青霉素雙抗（批號AB10166019）、胰蛋白酶（批號SH30042.01）均購自美國Hyclone公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，批號2035126，pH 7.4）購自以色列BI公司;NO檢測試劑盒（Griess法）（批號011020200430）購自北京索萊寶科技有限公司;LPS購自美國Sigma公司;CCK-8細胞增殖毒性測定試劑盒（批號BJ05203090）購自北京博奧森生物技術有限公司;IL-6（批號202012）、TNF-α（批號201922）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細胞株

小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法與結果

2.1 相關指標的檢測

2.1.1 色素波長的選擇及多糖脫色率的計算 管花肉蓯蓉多糖水提物經水適當稀釋后，使用紫外-可見分光光度計進行紫外-可見全波長掃描，結果未見最大吸收波長。因溶液呈現的顏色是溶液吸收光的互補色，管花肉蓯蓉多糖水提物脫色前后、稀釋前后均為黃棕色，可知溶液主要吸收藍色波段的可見光[13]。因此，選擇處于該波段吸光度較大的450 nm作為檢測波長，并按如下公式計算多糖脫色率：多糖脫色率（%）=（A1-A2）/A1×100%（式中，A1和A2分別為管花肉蓯蓉多糖水提物經大孔吸附樹脂處理前、后在450 nm波長處的吸光度）。

2.1.2 多糖質量濃度的測定及多糖保留率的計算 按2020年版《中國藥典》（一部）中靈芝多糖含量測定項下的硫酸-蒽酮法處理管花肉蓯蓉中多糖[14]：使用使用紫外-可見分光光度計于625 nm波長處測定吸光度（A），并根據回歸方程A=39.603c-0.077 1（R 2=0.999 8）計算管花肉蓯蓉多糖的質量濃度[15]，并按如下公式計算多糖保留率：多糖保留率（%）=c2/c1×100%（式中，c1和c2分別為管花肉蓯蓉多糖水提物用大孔吸附樹脂處理前、后管花肉蓯蓉多糖的質量濃度）。該方法的方法學考察結果均符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關規定[16]。

2.2 吸附脫色實驗

2.2.1 大孔吸附樹脂的預處理 AB-8大孔吸附樹脂（類型據前期研究結果選擇）用95%乙醇浸泡24 h，倒去浮在水面的小顆粒樹脂后，用水清洗至澄清、無醇味，然后分別用5%鹽酸溶液和5%氫氧化鈉溶液浸泡24 h，用水清洗至中性，最后用水浸泡并封存，備用。

2.2.2 洗脫方法 取經預處理的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g，置于錐形瓶中，加入質量濃度為8 mg/mL的管花肉蓯蓉多糖溶液50 mL，搖床振搖3 h，抽濾，接流出液，濃縮，烘干，備用。

2.2.3 實驗參數優化 在參考文獻[17-19]和前期單因素實驗的基礎上，以多糖脫色率、多糖保留率為指標計算綜合評分（根據前期研究結果設置權重均為50%），選用L9（34）正交實驗設計對大孔吸附樹脂脫色的洗脫流速（A，BV/h）、脫色時間（B，h）、上樣質量濃度（C，mg/mL）進行優化，確定管花肉蓯蓉多糖的大孔吸附樹脂脫色最優工藝條件。管花肉蓯蓉多糖大孔吸附樹脂脫色的正交實驗因素與水平見表1，實驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2的極差結果可知，各因素對綜合評分的影響由高到低為C>A>B，說明上樣質量濃度對大孔吸附樹脂脫色效果的影響最大，其次是洗脫流速和脫色時間。由表3的方差分析結果可知，上樣質量濃度和洗脫流速對大孔吸附樹脂的脫色效果均有顯著影響，脫色時間的影響不顯著。根據上述正交實驗結果可知，大孔吸附樹脂脫色的最優參數組合為A2B1C3，即洗脫流速1.2 BV/h，脫色時間9 h，上樣質量濃度25 mg/mL。

2.2.4 驗證實驗 取質量濃度為25 mg/mL的管花肉蓯蓉多糖溶液3份，分別上樣至填有大孔吸附樹脂的層析柱（100 cm×6 cm）中，分別吸附9 h后開始洗脫，洗脫流速為1.2 BV/h，接流出液，濃縮后檢測多糖脫色率、多糖保留率并計算綜合評分。結果，3次重復試驗綜合評分分別為63.43%、63.29%、63.34%，平均值為63.35%（RSD=0.11%，n=3），表明此脫色方法可行。

2.3 管花肉蓯蓉粗多糖的初步分離

2.3.1 DEAE-650M離子交換填料的預處理 先把DEAE-650M離子交換填料倒入較大的容器內，加入3～4倍體積的水浸泡，等填料大部分沉底后棄去上清液，再加入水重復以上操作3～5次，備用。

2.3.2 粗多糖分離 將層析柱（80 cm×4 cm）垂直固定在層析架上，裝上經預處理的DEAE-650M離子交換填料，將已脫色的管花肉蓯蓉多糖（記為CTC）溶液250 mL，以25 mg/mL的質量濃度上樣至層析柱中，分別用水和系列濃度的氯化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）依次進行洗脫，收集洗脫液。其中，水洗脫下來的成分為中性多糖，不同濃度的氯化鈉溶液洗脫得到的為酸性多糖。將收集的洗脫液按洗脫曲線合并，經濃縮、透析后，凍干得到多個多糖組分。結果，分離出1種中性多糖，記為CTZ，含量為229.2 mg/g;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L氯化鈉溶液洗脫的各酸性多糖分別命名為CT-1、CT-2、CT-3、CT-4、CT-5，含量分別為168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。

2.4 管花肉蓯蓉多糖對巨噬細胞免疫活性的影響

2.4.1 細胞增殖率的檢測 采用CCK-8法進行檢測。實驗分為空白組[只含完全培養基（含有10%FBS、100 U/mL的鏈霉素和100 U/mL青霉素，下同）]、對照組（含細胞與完全培養基）和不同質量濃度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5組（含細胞、完全培養基和6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的管花肉蓯蓉多糖、中性多糖和各酸性多糖，根據預實驗結果設置質量濃度），每組設5個復孔。取對數生長期的RAW264.7細胞，用胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入完全培養基調整細胞濃度，并按1×105 mL-1接種至96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱（下同）內培養。待細胞貼壁后，每孔吸棄上清液，按上述分組加入完全培養基或含相應藥液的完全培養基，繼續培養24 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，室溫孵育1 h后，用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值并計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。管花肉蓯蓉多糖對RAW264.7細胞增殖率的影響見表4。

由表4可知，與對照組比較，6.25～100 μg/mL CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5組和6.25 μg/mL CTC組細胞的增殖率均顯著增加（P<0.05），6.25～100 μg/mL CT1、CT3組和50 μg/mL CTC組細胞的增殖率均顯著降低（P<0.05）。

按照毒性分級標準，細胞增殖率≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，<1%為5級，其中0和1級被認為對細胞無毒性[13]。結果，當CT1、CT3質量濃度為100 μg/mL時，毒性可達到2級，因此選擇12.5、25、50 μg/mL作為后續研究的低、中、高質量濃度。

2.4.2 NO釋放量的檢測 采用Griess法進行檢測。實驗分為對照組（含細胞與完全培養基）、LPS組（含細胞、完全培養基和終質量濃度為1 μg/mL的LPS）和低、中、高質量濃度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5組[含細胞、完全培養基、終質量濃度為1 μg/mL的LPS和低、中、高質量濃度（12.5、25、50 μg/mL）的管花肉蓯蓉多糖、中性多糖和各酸性多糖]，每組設3個復孔。取對數生長期的RAW264.7細胞，按“2.4.1”項下方法消化、重懸后，按1×105 mL-1接種至48孔板中，每孔300 μL，同法培養。待細胞貼壁后，吸棄去上清液，按上述分組加入完全培養基或含相應藥液的完全培養基，繼續培養48 h后，收集細胞上清液，以1 000 r/min離心15 min，取上清液，使用酶標儀在540 nm波長處檢測各孔的A值，按NO檢測試劑盒說明書方法計算NO釋放量，并按“2.4.1”項下方法進行統計分析，結果見表5。

由表5可知，與對照組比較，LPS組細胞的NO釋放量顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，低、中、高質量濃度CTC、CTZ（中、高質量濃度除外）、CT2、CT3、CT5組細胞的NO釋放量均顯著降低（P<0.05）;此外，高質量濃度CT1、CT4組細胞的NO釋放量均顯著升高（P<0.05）。

2.4.3 IL-6、TNF-α釋放量的檢測 按ELISA法進行檢測。取對數生長期RAW264.7細胞，按“2.4.1”項下方法消化、重懸后，按1×105 mL-1接種至48孔板中，每孔500 μL，同法培養。待細胞貼壁后，吸棄上清液，按“2.4.2”項下方法進行分組、加藥、培養，收集細胞上清液，以1 000 r/min離心15 min，收集上清液，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的A值，按ELISA試劑盒說明書方法計算IL-6、TNF-α釋放量，并按“2.4.1”項下方法進行統計分析，結果見表5。

由表5可知，與對照組比較，LPS組細胞的IL-6、TNF-α釋放量均顯著升高（P<0.05）。與LPS組比較，除高質量濃度CT1組細胞的IL-6釋放量顯著升高（P<0.05）、中質量濃度CT1組細胞的TNF-α和低質量濃度CT5組細胞的IL-6釋放量均無顯著變化（P>0.05）外，其余各組細胞的IL-6、TNF-α釋放量均顯著降低（P<0.05）。

3 討論

前期研究發現，水提管花肉蓯蓉中多糖時會有較多水溶性物質一同溶出，影響管花肉蓯蓉多糖純度，因此進一步對其進行分離純化，可為多糖物質基礎及生物活性研究奠定基礎。大孔吸附樹脂法是常用的脫色方法[17-19]。由于目前還不清楚管花肉蓯蓉中色素成分的極性，所以課題組前期通過靜態吸附實驗，從不同極性的大孔吸附樹脂中篩選了最適大孔吸附樹脂AB-8，該樹脂對非目標成分具有較好的吸附能力，又對管花肉蓯蓉多糖具有較好保留能力。為達到更好的脫色效果，本研究在前期研究基礎上，采用正交實驗對脫色工藝（洗脫流速、脫色時間、上樣質量濃度）進行了優化。結果，管花肉蓯蓉多糖的最優脫色方法為洗脫流速1.2 BV/h，脫色時間9 h，上樣質量濃度25 mg/mL。驗證實驗結果顯示，本脫色方法可行。

天然多糖的純度及種類是影響其活性的重要因素，因此多糖分離純化方法的相關研究仍然是天然活性多糖研究工作的重點。多糖分離常用的方法有沉淀法、凝膠色譜法、陰離子交換色譜法、大孔樹脂柱色譜法和超濾法等[20]。多糖因單糖組成不同，其所帶電荷性質也會有一定的差異，可被分為中性多糖和酸性多糖。中性多糖是由2種以上不含有機酸的不同糖基單體構成的聚合物;而酸性多糖在組成成分和結構上要比中性多糖復雜，除含有2種以上的糖基單體外，還含有糖醛酸單體[21]。陰離子交換柱層析法是利用多糖所帶電荷的差異將中性多糖與酸性多糖進行分離[22]。為此，本研究采用DEAE-650M離子交換柱層析柱對管花肉蓯蓉多糖進行分離，共分離出1種中性多糖、5種酸性多糖。

巨噬細胞是免疫活性細胞，可通過吞噬和殺傷病原微生物，從而起到調節免疫的作用。已有研究表明，當人體受到病理或機械損傷刺激時，藥物干預可激活巨噬細胞使LPS誘導的巨噬細胞吞噬能力增強，進而抑制NO的產生和IL-6、TNF-α等系列炎癥細胞因子的分泌，從而保護宿主免受病原體的侵害[23]。為此，本研究檢測了各種管花肉蓯蓉多糖對RAW264.7細胞增殖率的影響，以及對LPS誘導巨噬細胞釋放NO、IL-6、TNF-α的影響。結果，在12.5、25、50 μg/mL質量濃度范圍內，既對RAW264.7細胞增殖起一定的促進作用，又可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO、IL-6、TNF-α的管花肉蓯蓉多糖為CT2。相關研究顯示，多糖的單糖組成和分子量會影響其免疫調節活性，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖等單糖與多糖的免疫活性成正相關[24]，分子量較大的多糖可能含有較多的高度重復結構，可以多向性交叉連接質膜表面受體，特異性增強免疫調節效果[25]。因此本研究中的酸性多糖CT2的單糖組成中可能含有特殊的單糖或含多個與免疫活性正相關的單糖，且分子量可能較中性多糖和其他酸性多糖大，但有待進一步研究確認。

綜上所述，本研究所優化的大孔吸附樹脂脫色工藝穩定、可行;可從管花肉蓯蓉多糖水提物中分離出1種中性多糖、5種酸性多糖，其中酸性多糖CT2的免疫活性較強。本研究可為管花肉蓯蓉多糖的開發利用奠定實驗基礎。

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（收稿日期：2021-01-24 修回日期：2021-05-31）

（編輯：鄒麗娟）