人參二醇對APP-SH-SY5Y細胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信號通路的影響

梁喜才 藺瑩 肖洪賀 孔亮 楊靜嫻

摘要目的：研究人參二醇（PD）對轉染APP基因的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y）中Tau 蛋白磷酸化的影響及其作用機制。方法：采用分子對接技術驗證PD 與非受體酪氨酸激酶Fyn 的靶向性。在體外培養SH-SY5Y 細胞，構建APP-SH-SY5Y細胞模型和綠色熒光蛋白（GFP）-SH-SY5Y細胞模型（對照細胞），通過檢測細胞中β淀粉樣蛋白（Aβ1-42）的表達來驗證APP-SH-SY5Y細胞模型是否構建成功。以GFP-SH-SY5Y細胞為對照，采用CCK-8 法檢測5、10、20、30、40 μmol/L 的PD 和125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的PP2（Fyn 抑制劑，陽性對照）作用24 h 對APP-SH-SY5Y細胞存活率的影響，以確定最佳給藥濃度。以APP-SH-SY5Y細胞為對象，分別檢測最佳濃度PD、PP2 作用24 后細胞中Ca2+濃度及磷酸化Tau 蛋白（p-Tau）/Tau、磷酸化非受體酪氨酸激酶Src（p-Src）/Fyn、磷酸化谷氨酸受體2B（p-GluN2B）/GluN2B比值。結果：分子模擬對接結果顯示，PD可靶向結合Fyn 蛋白。與GFP-SH-SY5Y細胞比較，APP-SH-SY5Y細胞中Aβ1-42蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。PD和PP2 的最佳作用濃度分別為20 μmol/L和500 nmol/L。20 μmol/L PD、500 nmol/L PP2 均可顯著升高細胞的存活率，顯著降低細胞中Ca2+濃度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。結論：PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路來降低APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度及Tau蛋白的磷酸化水平。

關鍵詞人參二醇;轉染APP基因的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y;Tau 蛋白;磷酸化;非受體酪氨酸激酶Fyn/谷氨酸受體2B信號通路

ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effects and mechanism of panaxadiol（PD） on Tau protein phosphorylation in theSH-SY5Y cells transfected with APP gene（APP-SH-SY5Y）. METHODS：The target of PD and non-receptor tyrosine kinases Fynwas verified by molecular docking. SH-SY5Y cells were cultured in vitro，and the APP-SH-SY5Y cell models and green fluorescent（GFP）-SH-SY5Y cell model（control cell）was constructed. The expression of Aβ 1-42 was detected so as to verify the success ofAPP-SH-SY5Y cell model. Taking GFP-SH-SY5Y cells as control，the effects of 5，10，20，30，40 μmol/L PD and 125，250，500，1 000，2 000 nmol/L PP2（Fyn inhibitor，positive control）on the survival rate of APP-SH-SY5Y cells were detected byCCK-8 assay after treated for 24 h， so as to confirm the optimal concentration. The concentration of Ca2 + ， the ratiofophosphorylated Tau protein（p-Tau）/Tau，phosphorylatedn Src（p-Src）/Fyn and phosphorylated glutamate receptor2B（p-GluN2B）/GluN2B were detected in APP-SH-SY5Y cells after trated with the optimal concentration of PD and PP2 for 24 h. RESULTS：Theresults of molecular simulation docking showed that PD could target Fyn protein. Compared with GFP-SH-SY5Y cells，the proteinexpression of Aβ1-42 in APP-SH-SY5Y cell were increased significantly（P<0.01）. The optimal concentration of PD and PP2 were20 μmol/L and 500 nmol/L. The 20 μmol/L PD and 500 nmol/L PP2 could increase the survival rate of the cells and reduced theconcentration of Ca2 + ，the ratio of p-Tau/Tau，p-Src/Fyn，and p-GluN2B/GluN2B. CONCLUSIONS：PD can reduce the thephosphorylation of Tau protein through inhibiting Fyn/GluN2B signaling pathway.

KEYWORDS Panaxadiol;APP-SH-SY5Y cells;Tau protein;Phosphorylation;Fyn/GluN2B signaling pathway

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種進行性的神經退行性疾病，患者通常會出現以記憶力衰退、學習能力減弱為主的癥狀，并伴有情緒調節障礙以及運動能力喪失[1]。目前主流觀點認為，AD的病因與β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）和Tau 蛋白過度磷酸化造成的神經元大量死亡而導致的認知缺陷有關[2]。其中，Tau 蛋白的過度磷酸化是由Aβ神經毒性引起的病理生理級聯反應，而磷酸化的Tau 蛋白同樣影響著Aβ的沉積，進一步協同產生神經毒性，形成惡性循環，最終導致神經系統衰竭、神經變性和認知能力下降[3-4]。已有研究證實，Aβ可通過激活非受體酪氨酸激酶Fyn 并開放谷氨酸受體2B（GluN2B）通道，引起Ca2+大量內流，進一步誘導Tau 蛋白的過度磷酸化[5-8]。可見，Fyn/GluN2B信號通路可通過調控Tau 蛋白的磷酸化而影響AD的發生與發展。

人參二醇（panaxadiol，PD）是從人參Panax ginsengC. A. Mey.中提取得到的一種三萜皂苷類單體化合物，是人參的三大苷元之一，在人參總皂苷水解物中的含量高達8.75%[9]。PD 具有多種藥理作用，包括抗癌、抗缺氧損傷、抗自由基等[10-13]。同時，PD對Aβ損傷的神經元具有保護作用[14-15]。APP基因是較早被發現的AD患者腦內的突變基因之一，表達APP基因的細胞系能夠分泌高水平的Aβ，該細胞系已被廣泛用于AD的研究[16]。本課題組前期成功構建了APP 基因轉染的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y（APP-SH-SY5Y 細胞）來模擬Aβ沉積致AD發病的細胞模型，并發現PD對該細胞具有神經保護作用，但其保護機制尚不明確。鑒于此，本研究擬考察PD 對APP-SH-SY5Y 細胞中Tau 蛋白磷酸化及Fyn/GLuN2B信號通路的影響，以期為PD防治AD提供新的理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Ti-S 型熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司;TGL-20M型臺式高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器公司;NU-4750E型CO2培養箱購自美國Nuaire 公司;MR-96A型酶標儀購自美國Molecular Devices 公司;UV-5600 型紫外-可見光分光光度計購自上海元析儀器有限公司;Tanon-5200 型自動化學發光圖像分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

PD 對照品（批號19666-76-3，純度98.36%）購自成都普菲德生物技術有限公司;Fyn 抑制劑PP2 對照品（陽性對照，批號172889-27-99，純度>98%）購自美國MedchemExpress 公司;DMEM 高糖培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液和青霉素/鏈霉素（P/S）雙抗均購自美國Gibco 公司;綠色熒光蛋白（GFP）-APP 質粒、GFP質粒以及pLP1 質粒、pLP2 質粒、pLP/VSV-G質粒均由本課題組前期自行構建;脂質體-2000 轉染試劑、聚凝胺轉染增強劑均購自美國Invitrogen 公司;全蛋白提取試劑盒（批號KGP250）、BCA 法蛋白定量檢測試劑盒（批號KGP902）、CCK-8 法細胞增殖檢測試劑盒（批號KGA317）均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;CalbryteTM520 AM試劑盒（批號21131）購自美國AAT Bioquest公司;兔抗鼠、Fyn 多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司;兔抗鼠磷酸化Src（p-Src）多克隆抗體購自美國RD 公司;兔抗鼠A β 1-42 GluN2B、磷酸化（p-GluN2B）、Tau、磷酸化Tau（p-Tau）多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司;兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體購自美國Abcam 公司;辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自武漢ABclonal 公司;熒光素Cy3 標記的驢抗兔IgG 二抗購自美國Jackson 公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為去離子水。

1.3 細胞

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y、人源胚胎腎細胞293T（human emborynic kidney 293T，HEK 293T）均由首都醫科大學提供。

2 方法

2.1 PD與Fyn蛋白的分子模擬對接

以“panaxadiol”為關鍵詞，在中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，https：//tcmspw.com）中檢索得到PD 的二維結構，保存為“mol2”格式文件;以“Fyn”為關鍵詞，通過PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）檢索并下載Fyn 的蛋白結構，保存為“mol2”格式文件。將兩者的“mol2”格式文件分別導入AutoDockTools-1.5.6 軟件中，調整X、Y、Z 坐標軸并用Autodock vina 1.1.2 軟件進行模擬對接。對接完成后，用Discovery Studio 2017 軟件顯示對接后的作用力，并以對接評分來評估結合親和力。若評分<-4.0，則認為化合物與靶點蛋白具有較強的親和力[17]。以Fyn 抑制劑PP2 為陽性對照，同法進行PP2與Fyn蛋白的分子模擬對接。

2.2 APP-SH-SY5Y細胞模型的構建

將GFP（或GFP-APP）質粒15 μg、pLP1 質粒6.5 μg、pLP2 質粒2.5 μg、pLP/VSV-G 質粒3.5 μg 與DMEM 高糖培養基250 μL 混合均勻，在室溫下孵育5 min。用脂質體-2000 介導轉染HEK 293T 包裝細胞，分別于轉染24、48、72 h 時收集上述HEK 293T 細胞培養液的上清液。將上述上清液混合后，以3 000 r/min 離心20 min 去除細胞碎片，然后以0.22 μm濾膜過濾，濾液用100 kDa超濾管以5 000 r/min 離心1 h，得到濃縮液。再將SH-SY5Y細胞以1×106個/孔接種于6 孔板中，待細胞生長至密度為70%時，棄去培養液;加入0.5 mL上述濃縮液、0.5 mL不完全培養基（不含P/S 和FBS 的DMEM高糖培養基）和聚凝胺轉染增強劑（10 μg/mL）適量后，置于37 ℃、5%CO2培養箱（下同）中常規培養12 h，然后換成完全培養基（含P/S 和FBS 的DMEM高糖培養基）繼續培養;培養至第3 天時，將培養基換為含有嘌呤霉素（4 μg/mL）的完全培養基繼續培養，每2 天換液1 次，培養1周后用于實驗。

2.3 APP-SH-SY5Y細胞模型構建情況的驗證

采用Western blot 法進行檢測。取第2 代APP-SHSY5Y細胞和GFP-SH-SY5Y細胞，分別以1×106個/孔接種至6 孔板中，分別作為APP組和GFP組（對照組）。常規培養12 h 后，根據全蛋白提取試劑盒說明書方法提取細胞中總蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量后，在沸水浴中煮沸5 min 進行變性。取變性后蛋白（20 μg）進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓80 V，電泳時間2.5 h），然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上（電壓80 V 轉印0.5 h）。用5%脫脂奶粉封膜1 h，加入Aβ1-42（稀釋比例為1 ∶ 400）、β-actin（稀釋比例為1 ∶ 2 000）一抗，4 ℃孵育過夜;TBST 緩沖液洗膜5 min×4 次，加入HRP 標記的IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶800），室溫孵育1h。ECL顯色后，用全自動化學發光圖像分析儀拍照，保存。以β-actin 為內參，采用Image J 1.51 軟件檢測條帶灰度值，以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3 次。

2.4 PD和PP2 給藥濃度的考察

采用CCK-8 法檢測細胞存活率，以確定PD 和PP2的最佳給藥濃度。將APP-SH-SY5Y細胞以1×104個/孔接種到96 孔板中（含完全培養基，下同），然后將其分為不同濃度的PD（5、10、20、30、40 μmol/L，濃度依據前期預實驗結果設置）組（記為“APP+PD組”）和不同濃度的Fyn 抑制劑PP2（125、250、500、1 000、2 000 nmol/L，濃度依據前期預實驗結果設置）組（記為“APP+PP2 組”），每組均設置3 個復孔;同時，另設加入GFP-SH-SY5Y細胞的對照組（記為“GFP 組”）和空白組。經相應培養基培養24 h 后，向每孔中加入CCK-8 溶液10 μL，常規孵育2h。然后，使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的吸光度（A），并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。實驗重復3次。

2.5 細胞中Ca2+濃度的檢測

采用CalbryteTM 520 AM 探針法進行檢測。將APP-SH-SY5Y 細胞分別以1×104 個/孔接種到96 孔板中，然后將其分為GFP 組、APP 組、APP+PD組（PD濃度為20 μmol/L）和APP +PP2 組（PP2 濃度為500 nmol/L），每組設置3 個復孔。分別處理24 h 后，根據CalbryteTM520 AM 試劑盒說明書方法操作，使用熒光顯微鏡在610～640 nm波長范圍內掃描各孔的熒光情況并檢測其熒光強度，以此反映Ca2+濃度[18]。實驗重復3次。

2.6 細胞中Fyn、GluN2B、Tau蛋白磷酸化水平的檢測

采用免疫細胞化學法進行檢測。將APP-SH-SY5Y細胞分別以1×104個/孔接種到96 孔板中，按“2.5”項下方法進行分組、處理24 h 后，向各孔中分別加入4%多聚甲醛溶液50 μL，在4 ℃條件下固定30 min。細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，然后用0.1%Triton X-100 試劑在室溫下透化5 min;再用PBS 洗滌3 次，然后分別加入相應一抗（Fyn 稀釋比例為1 ∶ 500，p-Src 稀釋比例為1 ∶800，GluN2B、p-GluN2B 稀釋比例均為1 ∶1 000，Tau、p-Tau 稀釋比例均為1 ∶400）50 μL，4 ℃孵育過夜;吸棄培養液，用PBS 洗滌細胞3 次，再加入熒光素Cy3 標記的IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶200，室溫下孵育1 h;加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）試劑，室溫避光孵育15 min，用PBS 洗滌3 次。使用熒光顯微鏡拍攝照片，然后用Image J 1.51 軟件測定細胞的熒光強度，以磷酸化蛋白和總蛋白熒光強度的比值表示該蛋白的磷酸化水平。實驗重復3 次。

2.7 統計學方法

使用GraphPad Prism 5 軟件對數據進行統計分析。實驗結果以x±s 表示，兩組間比較采用t 檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 PD與Fyn蛋白的分子模擬對接結果子對接結果顯示，PD、PP2 與Fyn 蛋白的氨基酸殘基均可以形成較強的氫鍵（PD 的對接評分=-9.5;PP2 的對接評分=-9.1），兩者具有很好的空間及電性互補特征，易于形成穩定的結合構象。該結果表明，PD與Fyn 蛋白具有強相互作用，脫靶可能性較小，可為后續實驗驗證提供理論依據。PD、PP2 與Fyn 蛋白的分子對接2D圖見圖1。

3.2 APP-SH-SY5Y細胞模型的建立情況分析結果與GFP組（0.21±0.11）比較，APP組細胞中Aβ1-42蛋白的表達水平（0.82±0.08）顯著升高（P<0.01），表明APP-SH-SY5Y細胞模型構建成功。GFP組和APP組細胞的熒光顯微圖見圖2（圖中，白光表示白光鏡下圖，熒光表示GFP熒光圖，合并表示兩者的合并圖），Aβ1-42蛋白表達的電泳圖見圖3。

3.3 PD和PP2 給藥濃度的篩選結果與GFP組比較，APP組細胞的存活率顯著降低（P<0.01）。與APP 組比較，各給藥組細胞的存活率均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）;且組間比較發現，當PD濃度達到20 μmol/L、PP2 濃度達到500 nmol/L 時，再增加藥物濃度后細胞的存活率均無顯著變化（P>0.05），因此以20 μmol/L PD和500 nmol/L PP2 進行后續實驗。各組細胞存活率的檢測結果見表1。

3.4 各組細胞中Ca2+濃度的檢測結果與GFP組比較，APP組細胞中Ca2+的濃度顯著增強（P<0.01）;與APP組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中Ca2+的濃度均顯著減弱（P<0.01）。各組細胞中Ca2+濃度的檢測結果見表2、其顯微圖見圖4（圖中，綠色表示GFP熒光;紅色表示CalbryteTM 520熒光;合并為兩者合成圖）。

3.5 各組細胞中Tau蛋白磷酸化水平的檢測結果與GFP 組比較，APP 組細胞中p-Tau/Tau 比值顯著升高（P<0.01）;與APP組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中p-Tau/Tau 比值均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中Tau 蛋白磷酸化水平的檢測結果見表3，其熒光顯微圖見圖5。

3.6 各組細胞中Fyn/GluN2B 信號通路相關蛋白磷酸化水平的檢測結果與GFP組比較，APP組細胞中p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B 比值均顯著升高（P<0.01）;與APP 組比較，APP+PD、APP+PP2 組細胞中上述指標比值均顯著降低（P<0.05）。各組細胞中Fyn/GluN2B 信號通路相關蛋白磷酸化水平的檢測結果見表3，其熒光顯微圖見圖6。

4 討論

據2019 年的一項研究指出，我國約有1 450 萬AD患者，隨著人口老齡化的加劇，AD的患病率也將不斷上升，預計到2050 年，我國AD患者將超過3 000 萬[19]。AD病因復雜，學術界至今仍未完全闡明其發病的具體機制。有研究認為，Tau 蛋白的過度磷酸化是AD病機之一，p-Tau 蛋白的積累會造成神經元的死亡并導致記憶喪失[2]。然而，Tau 病理學的發展是一個復雜的多因素過程，減少AD患者腦中Tau 蛋白磷酸化的機制仍有待進一步深入研究。有研究表明，Tau 蛋白的磷酸化與Fyn活性有關，Fyn 的激活可促進APP 轉基因小鼠腦中Tau蛋白的磷酸化，而抑制Fyn 活性則可減少其Tau 蛋白的磷酸化[20]。這提示，抑制Fyn 活性可緩解AD 的病理進展。

本研究先通過分子模擬對接發現，PD與Fyn 蛋白具有強烈的親和力，提示PD 可靶向抑制Fyn 蛋白活性。接著，本研究構建了APP-SH-SY5Y細胞模型來驗證PD能否通過抑制Fyn 活性從而發揮對AD的改善作用。該細胞模型可以模擬AD患者腦內Aβ對神經系統的損害，包括降低細胞存活率、促進乳酸脫氫酶釋放、誘導細胞凋亡等[21-22]。本研究結果表明，經PD干預后，APP-SHSY5Y細胞的存活率顯著升高;同時，筆者還觀察到APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度顯著增加，這可進一步引起Tau 蛋白的磷酸化[5-8]，而PD和Fyn抑制劑PP2 均可降低APP-SH-SY5Y細胞中Ca2+濃度及Tau 蛋白的磷酸化水平。

為了闡明PD抑制Tau 蛋白磷酸化的潛在機制，筆者進一步驗證了Fyn/GluN2B 信號通路相關蛋白在APP-SH-SY5Y 細胞中的表達情況。結果顯示，在APP-SH-SY5Y細胞中，Aβ引起了Fyn/GluN2B信號通路的激活;而PD和PP2 干預24 h 后，APP-SH-SY5Y細胞中p-Tau/Tau、p-Src/Fyn（Fyn是Scr 家族中的一員，p-Src/Fyn比值可反映Fyn 蛋白的磷酸化水平）、p-GluN2B/GluN2B比值均顯著降低。這提示，PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路阻斷Aβ引起的神經毒性，從而降低Tau 蛋白的磷酸化水平。

綜上所述，PD可通過抑制Fyn/GluN2B信號通路抑制APP-SH-SY5Y細胞中Tau 蛋白的磷酸化，為PD治療AD提供了科學依據。但本研究僅從激活Fyn 的角度闡述了PD 的可能作用機制，未在其沉默條件下進行驗證。在后續實驗中，筆者將采用APP/PS1 雙轉基因小鼠為AD動物模型，在體內深入探討PD對該模型小鼠腦內Tau蛋白磷酸化的影響。

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（收稿日期：2020-12-01 修回日期：2021-04-08）

（編輯：林靜）