質子轉移反應-飛行時間質譜快速鑒別金線蓮產地

張金偉, 何聿， 邱彬， 李小晶, 張丹丹， 余文濤， 林振宇

(1. 福州大學食品安全與生物分析教育部重點實驗室， 福建省食品安全分析與檢測技術重點實驗室， 福建 福州 350108；2. 福州大學環境與資源學院， 福建 福州 350108; 3. 福州海關技術中心， 福建 福州 350001;4. 福州商學院， 福建 福州 350001)

0 引言

金線蓮是蘭科開唇蘭屬植物， 不耐寒， 喜溫暖濕潤， 故主要生長于亞熱帶季風氣候區域， 如福建、 臺灣、 廣西、 云南等地[1]. 金線蓮具有“藥王”的美稱， 具有清熱解毒， 涼血除濕， 降血壓的功效[2]. 近年來， 科研工作者們利用不同檢測手段對不同產地金線蓮的主要成分及含量進行了檢測， 實驗結果表明， 福建金線蓮的藥用有效成分明顯高于其他產地金線蓮[3-7]. 這也導致有不法商人通過亂標產地， 以次充優來謀取暴利， 嚴重損害消費者的利益. 因此很有必要建立一種不同產地金線蓮的快速鑒定手段.

目前中藥材成分的檢測和鑒定手段主要有氣相色譜法[8]、 液相色譜[9-10]、 氣相質譜-質譜聯用法[11]、 液相色譜-質譜聯用法[12]等. 但這些方法前處理繁瑣、 耗時長、 且樣品不可回收， 而質子傳遞反應飛行時間質譜儀則可以解決以上問題.

質子轉移反應-飛行時間質譜(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometer, PTR-TOF-MS)是近幾年迅速發展的痕量揮發性有機物檢測技術， 由Werner Lindinger 及其課題組成員結合化學電離源技術與流動漂移管模型技術于20世紀90年代首次提出[13]. PTR-MS具有快速、 靈敏度高、 無需樣品前處理、 操作簡單等優點， 可以實現揮發性有機化合物(volatile organic compounds， VOCs)的實時在線監測， 目前已被廣泛應用于環境檢測[14]、 醫療診斷[15]、 大氣監測[16]、 食品科學[17]等各領域. 2016年， Acierno V課題組[18]采用PTR-TOF-MS對不同品種、 產地、 品牌的巧克力進行揮發性成分的指紋圖譜收集， 并建立數學識別模型. 2018年， Farneti課題組[19]利用PTR-TOF-MS對蘋果的香氣成分進行了分析. Nikolaos等[20]使用PTR-MS鑒別了純正藏紅花、 摻假藏紅花以及市場上低質量的藏紅花.

本研究首次將PTR-TOF-MS應用于不同產地金線蓮的快速鑒定. 通過對不同產地金線蓮進行香氣指紋圖譜檢測， 并結合化學計量學建立數學識別模型， 以建立一種快速、 準確、 便捷的金線蓮不同產地快速鑒定方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PTR-TOF-MS1000質子轉移反應飛行時間質譜儀(奧地利 Ionicon 有限公司) ， Agilent 7697A頂空進樣器 (美國安捷倫科技有限公司)， EL104 型電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司) .

試驗共收集福建金線蓮樣本26個， 廣西金線蓮樣本22個， 臺灣金線蓮樣本18個. 樣品用復合鋁箔袋密封, 于25 ℃儲存待用.

1.2 試驗方法1.2.1 條件優化

不同頂空平衡條件影響目標物質的響應值大小， 響應值太小可能會導致無法檢測到部分濃度太低但具有差異性的揮發性成分. 因此在進行數據采集之前， 需對頂空平衡時間和頂空平衡溫度進行優化. 選取福建金線蓮(漳州批次)主要揮發性成分中響應值高低不同的10種物質(質荷比分別為33.033 5、 42.033 8、 45.033 5、 59.049 1、 75.044 1、 87.080 4、 107.048 8、 111.153 7、 137.123 1、 164.251 2 )做為參照峰進行條件優化.

1.2.2數據采集

首先將頂空自動進樣器與PTR-TOF-MS聯用. 準確稱取0.3 g金線蓮樣品 (未經過任何前處理)于10 mL頂空瓶中， 在80 ℃條件下恒溫15 min以使頂空瓶內香氣揮發物達到平衡. 接著利用PTR-TOF-MS對金線蓮的香氣指紋圖譜進行收集. PTR-TOF-MS儀器條件如下： 漂移管電壓640 V, 漂移管溫度80 ℃， 漂移管壓力 225 Pa, 相對電場強度(E/n) 140 Td, 漂移管中氣體流量40 Pa·m3·s-1, 質荷比掃描范圍為13～500. 每個樣品以每秒一張全譜圖的采集速率測量60 s. 每個樣品獨立進行3次試驗, 取平均值， 得到樣本平均值. 取一個空瓶, 在相同的條件下進行檢測, 進行3次試驗， 取平均值， 得空白平均值. 樣本平均值減去空白平均值即得到進行統計分析的PTR-TOF-MS質譜數據.

1.2.3數據分析

利用SPSS22.0軟件及Simca-p軟件進行數學統計分析.

2 結果與分析

通過PTR-TOF-MS檢測可以獲取不同產地金線蓮的揮發性成分指紋圖譜， 通過對所得指紋圖譜進行數學建模可以實現不同產地金線蓮的分類識別. 各產地金線蓮的PTR-TOF-MS指紋圖譜如圖1所示.

圖1 不同產地金線蓮的PTR-TOF-MS指紋圖譜

2.1 條件優化2.1.1 頂空平衡溫度的優化

固定頂空平衡時間為10 min， 頂空平衡溫度分別為25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110 ℃， 觀察各物質響應值的變化， 結果如圖2所示. 通過固定平衡時間， 改變頂空平衡溫度可以發現， 大部分揮發性物質的響應值在80 ℃后上升緩慢， 因此選擇頂空平衡溫度為90 ℃作為頂空平衡條件之一.

圖2 不同產地金線蓮主要揮發性成分響應值隨平衡溫度的變化Fig.2 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating temperatures

2.1.2頂空平衡時間的優化

固定頂空平衡溫度為90 ℃， 頂空平衡時間分別為0、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 min， 觀察各物質響應值的變化， 結果如圖3所示. 通過固定平衡溫度， 改變頂空平衡時間可以發現， 大部分揮發性物質的響應值在15 min后上升緩慢， 因此選擇頂空平衡時間為15 min作為頂空平衡條件之一.

圖3 不同產地金線蓮主要揮發性成分響應值隨平衡時間的變化Fig.3 Changes of VOCs in anoectochilus at different heating times

2.2 快速準確識別方法的確立2.2.1 主成分降維

表1為主成分分析法中前10 個主成分的方差貢獻率.

表1 主成分分析法中前10 個主成分的方差貢獻率

對于大部分的判別分析方法來說， 太多的變量數目在建立模型時容易遭遇維數災難. 在建立數學模型前先采用主成分分析(principal components analysis, PCA)進行降維處理. 以85%～95%為范圍， 分別選取前2個主成分， 前3個主成分， 前4個主成分， 前5個主成分， 前6個主成分包含的質荷比數據作為降維后的數據建立各種數學分類模型.

2.2.2不同數學分類模型的識別結果

采用PCA降維后的數據分別與簇類獨立軟模式法(soft independent modeling of class analogy， SIMCA)[21]、K最近鄰法(K-nearest neighbor， KNN)[22]、 偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA)[23]和費希爾判別分析(fisher discriminant analysis， FDA)[24]等4種判別識別方法結合， 尋找一種性能最優異的數學分類識別模型, 用來建立基于質子傳遞反應-飛行時間質譜的不同產地金線蓮快速、 準確識別方法， 結果列于表2. 總樣本數(n)均為45.

表2 不同產地金線蓮的分類模型識別效果

由以上結果可以看出， 不同主成分數、 不同判別方法所建立的數學模型識別準確率各不相同. 其中， 當選取4個主成分數， 以FDA為判別方法時建立的數學分類識別模型準確率最高、 效果最佳， 總識別率達到97%. SIMCA法的準確率較低， 是因為其只是對各個主成分模型進行簡單擬合， 容易受到各種因素的干擾. 與SIMCA法相比， KNN法對每一個待測樣本進行分類預測都需要計算其與全體訓練集樣本之間的距離， 因此其誤差會較小， 準確率較高. 但是對于金線蓮這種產地之間差異變量多， 變量差異性小的樣本集來說， 提取的主成分數量少時會造成信息缺失， 訓練集和測試集的準確率都很低， 而提取的主成分數量多時， KNN法的泛化特性會導致訓練集識別率隨著更多有效信息的加入而提高， 但是測試集的識別效果卻因為樣本距離泛化大大降低. PLS-DA法與FDA法的準確率都要高于KNN法， 是因為PLS-DA法與FDA法作為線性模式的分類方法， 都對自變量進行重新投影來尋找一種更利于進行組間分類的線性組合從而進行判別， 因此其更能區分變量間的微小差異. 不同產地金線蓮之間的變量之間較為獨立， 即不是互相轉化引起的成分差異性變化. 因此采用正交投影方法最大化方差來增大組間距離， 從而區分不同組別物質的FDA法的識別正確率, 會比依賴于對相互依賴變量之間進行回歸分析到達分類目的的PLS-DA法更好一點.

3 結語

研究通過使用質子傳遞反應-飛行時間儀采集了不同產地金線蓮VOCs指紋圖譜， 并將其與幾種數學分類識別模型相結合， 篩選最適合金線蓮產地鑒別的分類模型. 實驗結果表明， 當主成分數為4， 判別分析方法為FDA時， 識別效果最好. 分析可知， 對于具有各種微小差異成分的不同產地金線蓮來說， FDA法建立的分類模型更為適用. 該方法具有快速、 準確、 無需樣品前處理， 操作簡單等優點， 為食品安全快速分析檢測提供了一種新思路. 該方法同樣可以推廣應用到其他農產品的產地溯源中.