基于轉錄組學的敦煌顫震方保護PD陰虛動風證大鼠DA能神經元的機制研究

孫雪 梁建慶 何建成 馬利芳

【摘 要】 目的：探討敦煌顫震方對PD陰虛動風證大鼠DA能神經元的保護機制。方法：根據大鼠腦立體定位圖譜，確定右側黑質二點坐標，6-OHDA腦立體定位注射法構建PD陰虛動風證模型。采用分層隨機法將12只PD陰虛動風證模型大鼠分為2組：模型組，敦煌顫震方組（14 g/kg），每組6只;另取6只大鼠不作造模處理設為正常組。敦煌顫震方組用0.9%氯化鈉溶液溶解，每天灌胃1次;正常組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液（2 mL/只）灌胃，連續灌胃6周。處死大鼠，取右側黑質及紋狀體組織，提取總RNA，IlluminaHi Seq平臺測序，檢測各組大鼠所有基因轉錄本的差異表達，篩選出與DA能神經元保護機制相關的信號通路及代謝途徑。結果：轉錄數據分析顯示：正常組和模型組（右側黑質/右側紋狀體）之間共篩選出143/149個顯著性差異表達基因，其中78/86個基因上調表達，65/63個基因下調表達。經過敦煌顫震方治療后，差異基因的表達富集程度明顯降低， PD模型大鼠PI3K-Akt、MAPK、cAMP、TNF、cGMP-PKG信號通路表達被抑制，氨基酸、蛋白質、維生素B6等代謝途徑被激活。結論：敦煌顫震方對PD陰虛動風證大鼠DA能神經元具有一定的保護作用，其機制可能與調節細胞自噬、細胞凋亡、神經細胞再生、神經炎癥、氧化應激、突觸可塑性、認知功能、氨基酸、蛋白質、維生素B6等信號代謝通路有關。敦煌顫震方可望成為DA能神經元保護劑。

【關鍵詞】 帕金森病;敦煌顫震方;轉錄組學;多巴胺能神經元

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）10-0014-08

Study on the Mechanism of Dunhuang Tremor Prescription Protecting DA Neurons in PD Rats with Yin Deficiency and Moving Wind Syndrome based on Transcriptome

SUN Xue1 LIANG Jianqing1，2* HE Jiancheng3 MA Lifang1

1.School of Basic Medicine， Gansu University of? TCM，Lanzhou 730000， China;

2. The Key Laboratory of the Ministry of Education of Dunhuang medicine and transformation，Lanzhou 730000，China;

3. School of Basic Medicine， Shanghai University of TCM， Shanghai 201203， China

Abstract：Objective To explore the protective mechanism of Dunhuang tremor prescription on DA neurons of PD rats with Yin deficiency and moving wind syndrome.Methods According to the stereotaxic map of the rat brain， the two-point coordinates of the right substantia nigra were determined， and the model of PD Yin deficiency and moving wind syndrome was established by 6-OHDA stereotaxic injection. Twelve PD rats with Yin deficiency and moving wind syndrome were randomly divided into two groups： model group， Dunhuang tremor prescription group （14 g / kg）， 6 rats in each group; another 6 rats were not treated as normal group. Dunhuang tremor prescription group was dissolved with 0.9% sodium chloride solution and administered to the stomach once a day; the normal group and the model group were administered with 0.9% sodium chloride solution of equal volume （2 mL/animal） for 6 weeks. Rats were killed， the right substantia nigra and striatum tissues were taken， total RNA was extracted and sequenced by illuminahi SEQ platform， the differential expression of all gene transcripts in each group was detected， and the signal pathway and metabolic pathway related to the protection mechanism of DA neurons were screened.Results The analysis of transcription data showed that 143 / 149 differentially expressed genes were screened between the normal group and the model group （right substantia nigra / right striatum）， of which 78 / 86 genes were up-regulated and 65 / 63 genes were down regulated. After the treatment of Dunhuang tremor prescription， the expression of differential genes was significantly reduced， the expression of PI3K Akt， MAPK， camp， TNF， cgmp-pkg signaling pathway was inhibited， and the metabolic pathways of amino acid， protein and vitamin B6 were activated.Conclusion Dunhuang tremor prescription has a certain protective effect on DA neurons of PD rats with Yin deficiency and moving wind syndrome. Its mechanism may be related to the regulation of signal metabolic pathways such as autophagy， apoptosis， nerve cell regeneration， neuroinflammation， oxidative stress， synaptic plasticity， cognitive function， amino acid， protein， and vitamin B6. Dunhuang tremor prescription is expected to be a protective agent for DA neurons.

Keywords：Parkinsons Disease; Dunhuang Tremor Prescription;Transcriptome;Dopaminergic Neuron

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是全球第二大神經退行性疾病，全世界現有約580萬PD患者，中國患病人數約為260萬，居世界第一位[1]。PD的主要病理特征是中腦黑質致密部多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性缺失，導致紋狀體內DA含量減少到80%以上，患者出現臨床癥狀[2]。明確DA能神經元損傷的機制，對PD的防治具有重要意義。筆者利用Illumina HiSeq高通量測序平臺技術，獲得正常組、模型組、敦煌顫震方組大鼠右側黑質及紋狀體的轉錄組信息，對篩選得到的差異表達基因進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，旨在為深入探究DA能神經元的存活方式以及對敦煌顫震方的藥理作用等分子應答機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及條件 健康雄性SPF級SD大鼠，體質量180～200g，鼠齡38～40周，18只，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號碼：SCXK（甘）2015-0002。飼養期間保持自由飲水和進食，飼養環境溫度為（24±1）℃，濕度為（55±5）%，實驗前適應性喂養1周。

1.2 主要試劑和儀器 6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA， 批號：MKBP0832V）、阿撲嗎啡（apomorphine，APO，批號：SLBF6369V）、抗壞血酸（批號：063K1082）：美國Sigma公司產品。戊巴比妥鈉（批號：WS20130212）：上海中西藥業股份有限公司產品;慶大霉素（批號： 20230675）：上海第一制藥廠產品，0.3 g/支。

大鼠腦立體定位儀：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司;高速冷凍離心機：Multifuge IS-R，德國THERMO公司;超聲破碎儀：XL 2000，美國MISONIX公司;微量進樣器：5 μL，上海第三分析儀器廠;漩渦混勻器：XW-80A，上海醫科大學儀器廠;分析天平：910324，Sartorius anglytic;秒表：926266，上海秒表廠。

1.3 藥物制備 敦煌顫震方組成：山茱萸20 g，牛膝20 g，黃芪20 g，桂枝12 g，桃仁12 g，枳殼10 g，茯苓10 g，檳榔10 g，白蒺藜10 g。按既定工藝煎煮成湯藥，由甘肅中醫藥大學中藥制藥實驗室提供。敦煌顫震方組的給藥劑量按人體每日用量換算成大鼠灌胃劑量，溶解于0.9%氯化鈉溶液，配制成相應灌胃濃度[3]。

1.4 模型制備、分組及給藥 采用Ungerstedt等[4]建立并經過本課題組驗證的二點法進行模型構建[5-8]。術前按常規進行行為測試，確認無異常旋轉行為后，用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨（商品名：新潔爾滅）常規消毒。無菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準，根據包新民等[6]著大鼠腦立體定位圖譜，確定右側黑質二坐標：①前囟后5.2 mm，正中線右側1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中線右側2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術要求部位小心鉆開顱骨，用5 μL微量進樣器將6-OHDA（溶于含0.2%維生素C的生理鹽水中，即秤量藥品抗壞血酸0.001 g，溶于生理鹽水0.5 mL中）注入右側黑質部（以1.0 mm/min速度緩慢進針），每孔3 μL，注射速度為1 μL/min，注射完畢后留針5 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術完成后，用醫用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7 d，待動物清醒后放回飼養籠中飼養。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發大鼠向一側旋轉，記錄開始旋轉至30 min內的旋轉圈數，以旋轉圈數平均7次/min者為合格的PD模型。

模型制備成功后，采用分層隨機法將12只PD陰虛動風證模型大鼠分為2組：模型組，敦煌顫震方組（14 g/kg），每組6只;另取6只大鼠不作造模處理設為正常組。敦煌顫震方組用0.9%氯化鈉溶液溶解，每天灌胃1次;正常組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液（2 mL/只）灌胃，連續用藥6周。處死大鼠，取右側黑質及紋狀體組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.5 實驗指標測定

1.5.1 樣品檢測 Nanodrop檢測右側黑質及紋狀體組織中RNA的純度（OD260/280）、濃度、核酸吸收峰;Agilent 2100檢測RNA的完整性，檢測指標包括：RIN值、28S/18S、圖譜基線有無上抬、5S峰。

1.5.2 文庫構建 樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一條cDNA（complementary DNA）鏈，然后加入緩沖液、dNTPs（Dideoxynucleotide）、RNase H（Ribonuclease H）和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后通過PCR（Polymerase Chain Reaction）富集得到cDNA文庫。

1.5.3 文庫質控 使用Qubit 2.0進行初步定量，使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后才可進行下一步實驗。Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>2 nM），完成庫檢。

1.5.4 上機測序 庫檢合格后，不同文庫按照目標下機數據量進行pooling，用IlluminaHi Seq平臺進行測序。委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.6 生物信息學分析 將下機數據進行過濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進行序列比對;根據基因在不同樣品組中的表達量進行差異表達分析、差異表達基因KEGG注釋及通路富集分析。

2 結果

2.1 各組比對結果作圖 將各組大鼠比對到不同染色體上的Reads進行位置分布統計，繪制Mapped Reads在所選參考基因組上的覆蓋深度分布圖，便于后續分析。如圖1所示。

2.2 差異基因表達篩選火山圖 正常組和模型組（右側黑質/右側紋狀體）之間有143/149個顯著性差異表達基因，其中78/86個基因上調表達，65/63個基因下調表達;正常組和敦煌顫震方組（右側黑質/右側紋狀體）之間有83/91個顯著性差異表達基因，其中47/50個基因上調表達，36/41個基因下調表達;模型組和敦煌顫震方組（右側黑質/右側紋狀體）之間有56/61個顯著性差異表達基因，其中31/31個基因上調表達，25/30個基因下調表達。如圖2所示。

2.3 差異基因表達篩選MA圖 通過MA圖可以直觀地查看兩組樣品之間差異基因表達水平的整體分布。具體結果見表1、圖3。

2.4 差異表達基因KEGG注釋 對差異表達基因KEGG的注釋結果按照KEGG中通路類型進行分類，分類結果如圖4所示。

2.5 差異表達基因KEGG通路富集分析 通過KEGG富集分析得到：PI3K-Akt Signaling pathway（PI3K-Akt信號通路）、MAPK Signaling pathway（MAPK信號通路）、cAMP signaling pathway（cAMP信號通路） 、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）、cGMP-PKG signaling pathway（cGMP-PKG信號通路）等通路， 這些均與PD相關;還發現Valine， leucine and isoleucine degradation（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解）、Protein digestion and absorption（蛋白質消化吸收）、Vitamin B6 metabolism（維生素B6代謝）等途徑的差異顯著，說明這些代謝途徑極有可能與DA能神經元分化相關。

3 討論

課題組以中西醫理論為基礎，結合多年的臨床經驗，認為PD病在筋脈，與肝、脾、腎等臟關系密切。基本病機為肝風內動，筋脈失養。《素問·痿論》曰：“肝主身之筋膜。”《素問·六節臟象論》云：“肝者……其充在筋。”《素問·經脈別論》道：“食氣入胃，散精于肝，淫氣于筋。”《素問·上古天真論》認為：“七八，肝氣衰，筋不能動。”肝為風木之臟，其氣血虧虛，筋脈失養，則肝風內動，筋脈不能任持自主，隨風而動，牽動肢體及頭頸顫抖搖動。《素問·陰陽應象大論》岐伯曰：“人年四十而陰氣自半也，起居衰矣。”肝腎乙癸同源，年高體衰，腎精漸虧，或勞欲過度，致肝腎陰虛，腎虛髓減，腦髓不充，風陽上擾，上盛下虛則高搖。肝木橫克脾土，可致痰濕內生。日久可導致絡脈瘀阻，出現肢體僵硬，動作遲滯乏力之象。故本病的病理性質為本虛標實證，本虛為肝腎虧損，臟腑功能失調;標實為風、痰、瘀互結，蘊塞腦竅。內風是本病病理演變過程中始終貫穿的因素之一，是發病的主要原因。故課題組提出“滋補肝腎、活血祛瘀、化痰消積”諸法合用是其治療法則。據此立法組方，充分挖掘敦煌醫學的文獻資料，研制了治療PD的中藥復方—敦煌顫震方[9]。該方由山茱萸、牛膝、黃芪、桂枝、桃仁、枳殼、茯苓、檳榔、白蒺藜組成，方中山茱萸性微溫味酸，歸肝、腎經，可補益肝腎、補精助陽。《日華子本草》認為山茱萸善“暖腰膝，助水臟。”牛膝性平味苦酸，歸肝、腎經，可補肝腎、強筋骨、活血祛瘀。共為君藥;黃芪性微溫味甘，歸脾、肺經，可補氣生血、活血壯筋骨。桂枝性熱味辛甘，入心經，根據中醫 “赤入心”的理論， 可助心陽、交心腎、暖腰膝、續筋骨、疏通血脈。二者配伍，可共奏活血祛瘀的作用。桃仁性平味苦，歸心、肝、肺、大腸經，可活血祛瘀。共為臣藥;枳殼性微寒味辛苦，歸脾、胃、大腸經，可破氣消積化痰。茯苓性平味甘淡，歸心、脾、腎經，可利水滲濕、健脾祛痰。檳榔性溫味辛苦，可行氣消積利水、導滯化痰。共為佐藥;白蒺藜性平味辛苦，歸肝經，可平肝疏肝、祛風平顫，為使藥。上述諸藥合用，可滋補肝腎、活血祛瘀、化痰消積。

本研究構建PD陰虛動風證大鼠模型[8]，給敦煌顫震方灌胃干預，并利用IlluminaHi Seq平臺進行測序，對PD大鼠黑質-紋狀體組織進行轉錄組測序，按照差異基因表達變化FDR≤0.01、log2 （Fold Change）≥|1|的原則，正常組和模型組（右側黑質/右側紋狀體）之間共篩選出143/149個顯著性差異表達基因，其中78/86個基因上調表達，65/63個基因下調表達。敦煌顫震方組明顯抑制了差異基因的表達富集程度。根據報道，PI3K-Akt信號通路在PD模型小鼠中被激活，抑制體內細胞自噬、促進細胞凋亡[10]。MAPK信號通路激活與氧化應激引起的PD細胞凋亡存在著密切聯系，若能抑制MAPK信號通路的激活則可能抑制神經細胞凋亡[11]。cAMP信號通路中cAMP（Cyclic adenosine monophosphate）作為一個經典的第二信使，參與機體的所有生理和病理活動[12]。cAMP表達水平升高，可能通過促進神經細胞存活、再生、分化，從而保護小鼠的認知功能[13]。TNF信號通路在PD的炎癥病理過程中起著重要作用。在PD 患者腦脊液和黑質-紋狀體系統中，TNF-α表達量較健康對照組增高，提示TNF-α對DA 能神經元造成了損害[14]。近年來，有關cGMP-PKG信號通路信號轉導的知識不斷涌現，cGMP的作用機制可能涉及調節神經炎癥、氧化應激、細胞凋亡、突觸可塑性和認知功能[15]。經過敦煌顫震方治療后，抑制PD模型大鼠上述信號通路的活化，調節細胞自噬、細胞凋亡、神經細胞再生、神經炎癥、氧化應激、突觸可塑性和認知功能等，這可能是敦煌顫震方發揮抗PD作用的機制。還發現氨基酸、蛋白質、維生素B6等代謝途徑與DA能神經元的存活有關。半個世紀以來，DA替代藥物左旋多巴-直是PD的臨床主導用藥，然而該藥長期應用會引起患者癥狀波動和運動障礙[16]。本研究結果顯示，敦煌顫震方可望成為DA能神經元保護劑，可再生與修復變性的DA能神經元，值得進一步研究。

參考文獻

[1]YADAV H P，LI Y.The development of treatment for Parkinsons disease [J].Adv Parkinsons Dis，2015，4（3）：59-78.

[2]梁建慶.帕金森病的發病機制、診斷標準及治療策略[J].解放軍醫學雜志，2018，43（8）：631-635.

[3]孫瑞元.定量藥理學[M].北京：人民衛生出版社，1987：247.

[4]UNGERSTEDT U.6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of Central monoamine neurons[J].Eur J Pharmacol，1968，5（1）：107-110.

[5]冉秋，何建成.一體化病證結合帕金森病大鼠模型中醫證候屬性研究[J].中國實驗動物學報，2011，19（6）：465-471.

[6]包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛生出版社，1991：49-58.

[7] CARMAN L S， GAGE F H， SHULTS C W. Par tial lesion of the substantia nigra： relation between extent of lesion and rotational behavior[J].Brain Res，1991，553（2）：275-283.

[8]梁建慶，何建成.病證結合大鼠帕金森病模型構建初探[J].中華中醫藥雜志，2016，31（5）：1854-1857.

[9]馬繼興.敦煌古醫籍考釋[M].南昌：江西科學技術出版社，1988：276.

[10]呂潤瀟，杜莉莉，周鳳華，等.迷迭香酸抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路促進細胞自噬緩解帕金森的機制研究[J].寧夏醫科大學學報，2019，41（12）：1189-1194.

[11]樊逸云.蟲草素對PD模型多巴胺能神經元的保護作用及其對MAPK和PI3K/Akt-Nrf2通路的影響[D].揚州：揚州大學，2019.

[12]祁有朝，李培鋒.TGR5受體介導的信號轉導通路的研究進展[J/OL].中國藥理學通報，2020（2）：153-157.

[13]李佳娜，郭蘇蘭，肖水秀.莪術二酮對腦缺血再灌注損傷小鼠認知功能及神經功能的保護作用研究[J/OL].中國比較醫學雜志，2020（2）：1-8.

[14]WHITTON P S.Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinsons disease[J].Pharma，2007，150 （8） ：963-976.

[15]FRAN A MER， PEIXOTO C A. cGMP signaling pathway in hepatic encephalopathy neuroinflammation and cognition[J]. Int Immunopharmacol，2020，79（12）：1-5.

[16]TANDRA S，RAMAVATH B，KANDADAI R M，et al.Functional Outcome of Bilateral Subthalamic Nucleus-Deep Brain Stimulation in Advanced Parkinsons Disease Patients：A Prospective Study[J]. Ann Indian Acad Neurol，2020，23（1）：54-58.

（收稿日期：2020-09-17 編輯：程鵬飛）

基金項目：國家自然科學基金（No.81573899，No.81660767）;敦煌醫學與轉化教育部重點實驗室開放課題（No.DHYX1516-08，No.DHYX18-08）;甘肅中醫藥大學中青年科研基金（No.ZQ2015-17）;甘肅中醫藥大學引進人才科研啟動基金（2016YJRC-07）。

作者簡介：孫雪（1994-），女，漢族，碩士研究生在讀，住院醫師，研究方向為中醫藥防治帕金森病。E-mail：929988026@qq.com

通信作者：梁建慶（1976-），男，漢族，博士，副教授，副主任醫師，碩士生導師，研究方向為中醫藥防治帕金森病。E-mail：1766424015@qq.com