一株血鸚鵡遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

徐赟霞　王禹　韓進剛　陳浩楠　馮守明

摘要：為確定天津市某養殖場血鸚鵡（Cichlasoma var.）發病死亡的原因，并對其進行有效的預防與治療，本試驗對患病的血鸚鵡進行病原的分離鑒定、回歸感染及藥敏試驗。從病灶處分離出一株疑似病原菌命名為XYW-1，經人工感染后具有致病性，臨床癥狀與自然發病癥狀一致，半致死濃度為4.75×10 5 CFU/mL;經生化鑒定和16S rDNA序列分析，XYW-1為遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）;以18種抗生素對遲緩愛德華氏菌進行了藥物敏感性測定，結果顯示遲緩愛德華氏菌僅對頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感。

關鍵詞：血鸚鵡（Cichlasoma var.）;遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）;分離鑒定;藥敏試驗

遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）為腸桿菌科愛德華菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，無莢膜，也不形成芽孢，廣泛存在于溪水、湖泊和海洋等水環境中，能感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類甚至哺乳類動物[1-2]，遲緩愛德華氏菌是愛德華氏菌屬中唯一能夠感染人的致病菌，它能引起人的腸胃炎、腹瀉等，較嚴重的還可以引起腦膜炎和敗血癥等疾病[3]。近年來遲緩愛德華氏菌對魚類健康的危害越來越嚴重，研究者們在斑馬魚[1]、大菱鲆[4]、斑點叉尾鮰、鯉魚、日本鰻鱺、尼羅羅非魚、漠斑牙鲆[5]、鱖魚[6]、雜交鱧[7]、黃鱔[8]等中都發現有遲緩愛德華氏菌感染。

血鸚鵡（Cichlasoma var.）又名紅財神、發財魚和財神魚，屬于淡水熱帶觀賞魚，由于其顏色鮮艷，形態可愛、抗病力強，對溫度適應能力強等特點深受天津市市民喜愛，成為天津地區主要觀賞魚養殖品種。但是隨著養殖密度的不斷提高，病害也逐年增加，給養殖戶造成經濟損失，有報道血鸚鵡感染嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌[9-10]等，但至今尚未見有血鸚鵡感染遲緩愛德華氏菌的報道。本研究通過對患病血鸚鵡進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，以期能夠找出血鸚鵡發病原因并提供用藥指導，為水產養殖生產中防治遲緩愛德華菌病提供參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

患病的和健康的血鸚鵡均來自天津市寶坻區某觀賞魚養殖場，腦心浸液肉湯培養基（BHI）、營養瓊脂（NA）、水解酪蛋白培養基（MH）、藥敏紙片均購自Oxoid公司;VITEK GN鑒定卡購自法國梅里埃生化公司;PCR所用的試劑購于普洛麥格（Promega）生物技術有限公司。

1.2病原菌的分離與純化

在無菌條件下，從患病的血鸚鵡肝臟、脾臟、腎臟中取樣，劃線接種于BHI瓊脂培養基上，置于培養箱內28 ℃培養24 h后，選擇從腎臟中分離的優勢菌落，在營養瓊脂上劃線純化，直至獲得純培養的菌株，轉接到營養瓊脂斜面上，備用。

1.3人工感染試驗

將健康的鸚鵡魚（體長8.76 cm±0.64 cm，體重47.21 g±2.67 g）暫養1周，水溫保持在27～28 ℃，無異常情況后進行人工感染試驗。將50尾健康的鸚鵡魚平均分成5組，將XYW-1菌株用生理鹽水洗脫分別制成3×108、3×107、3×106、3×105 CFU/mL的菌懸液，取以上4個濃度的菌懸液，按照0.1 mL/尾的劑量用無菌注射器對血鸚鵡進行腹腔注射，對照組注射0.1 mL的生理鹽水，持續觀察5 d，并記錄好死亡情況，對患病的血鸚鵡進行病原菌的分離鑒定，根據寇氏法[11]計算半致死劑量。

1.4生理生化鑒定

將病原菌接種在營養瓊脂上，對其進行革蘭氏染色，鏡下觀察其形態特征。在無菌條件下挑取單個菌落制成菌懸液，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統和VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化特性測定。

1.516S rDNA基因序列鑒定及發育樹構建

挑取單個菌落于30 μL去離子水中，100 ℃金屬浴10 min后，12 000 r/min離心1 min后取上清作為PCR模板。16S rRNA序列擴增引物27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1 492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，30 個循環，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增產物經電泳檢測后送金唯智生物科技（天津）有限公司測序。測序結果通過NCBI中BLAST檢索系統進行在線比對，選取與其同屬的細菌16S rDNA基因序列，用MEGA7軟件構建系統發育樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）獲得系統發育樹，通過自舉分析（Bootstraping）進行系統進化樹的評估自舉數據集為1 000次。

1.6藥敏試驗

將菌株用生理鹽水稀釋到0.5麥氏濃度，用無菌的棉拭子蘸取稀釋好的菌懸液均勻涂布于MH平板上，待平板表面干燥后，用鑷子將藥敏紙片輕輕放置在平板表面并壓緊，放置在28 ℃培養箱內培養24 h后用直尺量取抑菌圈直徑，試驗結果判斷參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準[12]。

2結果

2.1臨床癥狀及病原菌形態特征

患病的血鸚鵡主要表現為體表出血、潰爛，鱗片脫落，胸鰭基部腫脹，剖開魚腹，病魚肝臟、腎臟明顯腫大，脾臟失血呈粉紅色。從腎臟中分離獲得的優勢菌株XYW-1為革蘭氏陰性短桿菌，在營養瓊脂培養基上28 ℃培養24 h后，菌落為正圓形、灰白色、表面濕潤、邊緣整齊、凸起。

2.2人工感染試驗結果

經人工感染發病血鸚鵡的主要臨床癥狀與自然感染菌株的癥狀相似，其體表出血，鰓絲充血、有明顯的潰爛。從死亡的血鸚鵡的腎臟中分離到的菌株經鑒定后與XYW-1一致，而注射無菌生理鹽水的對照組無死亡現象，外觀特征無明顯變化，由此可以說明菌株XYW-1是引起血鸚鵡發病死亡的病原菌。根據寇氏法計算可知菌株對血鸚鵡的半致死劑量為4.75×105 CFU/mL（表1）。

2.3病原菌的生化特征

使用VITEK GN鑒定卡對其進行生理生化鑒定，生理生化反應見表2。XYW-1符合遲緩愛德華氏菌生理生化特性，結合細菌形態和生理生化結果可初步判定分離菌XYW-1為遲緩愛德華氏菌。

2.416S rDNA基因序列分析結果

病原菌XYW-1所擴增的16SrDNA基因序列長度為1 389 bp，以 NCBI 的 Blast 檢索系統對其進行序列同源性分析，構建系統進化樹，結果表明，XYW-1與愛德華氏菌屬自然聚類，并與檢索出的遲緩愛德華氏菌聚為一支，同源性高達99%以上。綜合生理生化鑒定結果和16S rDNA基因序列分析結果，確定菌株XYW-1為遲緩愛德華氏菌。

2.5藥敏試驗結果

從表3可以看出，菌株XYW-1對頭孢類的頭孢噻肟、頭孢吡肟，內酰胺類的阿莫西林、氨曲南，四環素類的多西環素和氯霉素類的氟苯尼考、氯霉素敏感;對頭孢呋辛、鏈霉素、新霉素和利福平中度敏感;而對環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、阿奇霉素、紅霉素、四環素和磺胺甲惡唑耐藥。

3討論

近年來，國內學者關于血鸚鵡細菌性疾病也有相關報道： 錢曉宇等[9]發現嗜水氣單胞菌感染血鸚鵡，臨床表現為體表出血，腹部腫大，鰓絲充血腫脹，肝臟腫大糜爛。梁利國等[10]發現銅綠假單胞菌感染血鸚鵡后，病魚眼球腫大、突出，眼瞼呈潰爛狀，肝臟呈黑紅色，膽囊腫大。本研究中對天津某觀賞魚養殖場病死的血鸚鵡進行了較系統的病原研究，從發病血鸚鵡腎臟分離到優勢菌并作分離純化培養，人工感染試驗證實分離菌能引起健康血鸚鵡發病與死亡，再分離的細菌經細菌學鑒定為同源感染菌，經生物學及分子生物學鑒定，分離菌為遲緩愛德華氏菌。這也是首次在血鸚鵡中分離到遲緩愛德華氏菌。

在天津市水產養殖動物發生細菌性疾病的時候大多仍采用抗菌藥物來控制其發生和流行，有效合理地應用抗生素是防治魚類細菌性疾病的重要措施之一。魚類遲緩愛德華菌病具有流行范圍廣、發病率和病死率高等特點[13]，目前已有20多種魚類可感染遲緩愛德華氏菌并致病。抗菌藥物的廣泛使用，導致其對多數抗生素產生耐藥性，本試驗中以18種抗生素對遲緩愛德華氏菌進行了藥物敏感性測定，結果顯示遲緩愛德華氏菌僅對頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林、氨曲南、多西環素、氟苯尼考、氯霉素7種藥物敏感，對其他藥物都產生了不同程度的耐藥，出現這種情況究其原因多半與濫用抗生素有關，另外觀賞魚在防治病害時，不需要考慮藥物殘留的因素，對抗菌藥物使用劑量和使用頻率問題也沒有限制，也是造成XYW-1對抗菌藥物敏感性低的原因。本研究試驗結果可作為由該菌引起的血鸚鵡疾病防治選藥時的參考，在生產養殖中可以使用頭孢噻肟、多西環素等高敏感藥物進行治療。

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Isolation， identification and drug sensitivity test of a strain of Edwardsiella tardata from Cichlasoma var.

XU Yunxia， WANG Yu， Han Jingang ，Chen Haonan，FENG Shouming

（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402，China）

Abstract：In order to determine the causes of the disease and death of Cichlasoma var.in Tianjin， and to effectively prevent and treat them， the pathogen isolation and identification， regression infection and drug sensitivity tests were carried out on Cichlasoma var.in this study.A pathogenic bacteria named XYW-1 was isolated from the affected Cichlasoma var.， the artificial infection was pathogenic， and produced the similar clinical symptoms in artificially infected Cichlasoma var.as the naturally infected cases， and LCD was 4.75×105 CFU/mL. By physiological and biochemical analysis and 16S rDNA sequence analysis， XYW-1 was Edwardsiella tarda. In this experiment， 18 antibiotics were used to test the drug sensitivity of Edwardsiella tarda，and the results showed that Edwardsiella tarda was only sensitive to 7 of them， including cefotaxime， cefepime， amoxicillin， amtronam， doxycycline， florfenicol and chloramphenicol.

Key words：Cichlasoma var.; Edwardsiella tarda; isolation and identification; drug sensitivity test

（收稿日期：2021-05-08）