海水魚神經壞死病毒致病機理研究進展

朱裕敏　劉葒　毛明光

摘要：神經壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）主要分布在地中海和太平洋西海岸，已在120多種魚中被檢測到，能引起魚類病毒性神經壞死病（viral nervous necrosis，VNN），是對海水魚類危害重大的病原之一。目前，隨著神經壞死病毒的基因序列、類型、診斷和預防技術等方面研究的不斷深入，其致病機理的報道也越來越多。本文概述了病毒附著、致病基因、細胞凋亡以及免疫逃避等幾個方面的研究現狀。

關鍵詞：神經壞死病毒;致病機理;免疫逃避;凋亡

中圖分類號：S941.419

20世紀80年代末，澳大利亞地區尖吻鱸（Lates calcarifer）幼魚出現大量死亡現象，Glazebrook等[1]在死亡幼魚的中樞神經中檢測到一種不具囊膜的病毒，這是NNV的首次被報道;同時期，日本科學家Yoshikoshi和Inoue[2]在死亡的條石鯛（Oplegnathus fasciatus）幼魚中也發現了同種病毒。從此NNV的神秘面紗逐漸被人們揭開，我國陳信忠等[3]、陳曉艷[4]已對NNV的基本概況進行綜述。

NNV的暴發主要發生在魚的早期生活史階段，目前在成魚中也有所報道。NNV感染的宿主范圍從海水養殖魚類延伸到淡水領域，逐漸蔓延至海洋無脊椎動物，其中大多數屬于雙殼類，頭足類、腹足類和甲殼類動物也有發現[5]。大部分無脊椎動物只攜帶NNV，不發病，但在海水魚類中會發生選擇性暴發。受病毒感染后的宿主通常表現為：食欲不振;異常的游泳行為比如螺旋、旋轉、循環游泳;簡單病理解剖后可發現膀胱膨脹，腦組織出血，魚鰾過度充氣并呈現蒼白色[6-7]。具體的臨床癥狀會根據魚的種類、發育階段、疾病階段以及環境溫度等因素影響而有所差異。

NNV的致病機理一直是人們研究的重點和難點，也是有效防治NNV的前提。本文主要對NNV在宿主細胞表面的附著、NNV致病區域、NNV復制過程中抑制和誘導細胞凋亡的機制以及免疫逃避作用等相關內容進行綜述，以期為NNV致病機理的深入研究提供參考。

1神經壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）概述

NNV是諾達病毒科中的一種。諾達病毒科可分為α諾達病毒屬（Alphanodavirus）和β諾達病毒屬（Betanodavirus），前者感染群體主要為昆蟲，而后者主要感染魚類。NNV屬于β諾達病毒[8]。NNV是大小為25～30 nm的RNA病毒，是最小的動物病毒之一，呈球形或二十面體形態，未包裹單層蛋白[9]。如圖1所示，NNV基因組是由兩條被分割的線性正義、單鏈RNA片段（RNA1和RNA2）組成[10-11]。在病毒入侵細胞后，以RNA1（3.1 kb）為模板合成RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），后期在細胞內完成病毒的轉錄與復制;RNA2（1.4 kb）編碼病毒的結構蛋白—衣殼蛋白;RNA3（0.4 kb）僅存在于病毒感染細胞的過程中，作用于編碼蛋白質B1和B2，是RNA1的亞基因組轉錄物，在病毒子中不存在[12-13]。

NNV主要危害病魚的中樞神經系統，特別是腦和視網膜，所以又被稱為空泡性腦-視網膜病（Vacuolating encephalopathy and retinopathy，VER）[14]。目前普遍以日本學家Nishizawa等[15]劃分的分類系統為NNV分類的主要依據，根據RNA2中的T4區，可將NNV分為四種主要基因型：河鲀NNV（Tiger puffer NNV，TPNNV）、鲹NNV（Striped jack NNV，SJNNV）、鲆鰈NNV（Buffer flounder NNV，BFNNV）、赤點石斑魚NNV（Red-spotted grouper NNV，RGNNV）[16-17]。另外，Johansen等[18]在大菱鲆中也發現了神經壞死病毒，即TNNV，為第五種基因型。根據不同種NNV的衣殼蛋白構建基因進化樹如圖2。

2神經壞死病毒的致病機理研究現狀

2.1NNV的附著

病毒在細胞表面上的附著是病毒進入細胞并引發宿主細胞感染的首要條件，但NNV是如何附著并進入細胞的，仍是未解之謎。Liu等[19]研究發現，在經過衣霉素預處理的條紋月鱧細胞系（striped snakehead，SSN-1）上，龍膽石斑魚（Epinephelus lanceolatus）NNV（DGNNV）顆粒與細胞的相互結合率顯著降低。衣霉素能夠抑制SSN-1細胞蛋白的N端糖基化，因此推測DGNNV可能附著在被感染細胞的N端糖基化的受體上。Chang等[20]利用免疫熒光染色、流式細胞術、免疫沉淀分析顯示細胞表面存在熱休克同源蛋白（heat shock cognate protein 70，HSC70），其與NNV衣殼蛋白之間具有相互作用。用HSC70抗血清預處理石斑魚鰭條細胞系（Grouper fin cells，GF-1），感染后1 h的NNV的RNA2表達水平明顯低于未處理的細胞。可以推斷HSC70可能作為NNV受體參與了NNV病毒在細胞表面的復制。

2.2NNV致病的決定區

RNA2能夠編碼病毒的衣殼蛋白，而衣殼蛋白又是NNV唯一的結構蛋白，它們與病毒的致病機理有密不可分的關系。不同基因型NNV的RNA和編碼蛋白的主要結構具有高度的相似性，但NNV仍存在明顯的宿主特異性。

由于對NNV病毒的致病區域尚不了解，為了評價控制宿主特異性的病毒因子，日本學者Iwamoto等[21]構建了黃帶鲹（Pseudocaranx dentex）NNV（SJNNV）和七帶石斑魚（Hyporthodus septemfasciatus）NNV（SGNNV）的嵌合病毒。實驗依次交換重組了兩種基因型病毒的RNA1和RNA2并轉染至E-11細胞中，分別對其原始宿主魚進行感染，探究其特異性。研究發現，七帶石斑魚被重組病毒（SJNNV的RNA1和SGNNV的RNA2）感染后，致死率可達100%，類似感染SGNNV，而黃帶鲹不受影響。相反，黃帶鲹接種重組病毒（SGNNV的RNA1和SJNNV 的RNA2）時，致死率也可達到100%。此結果表明，RNA2是NNV致病的決定基因。為準確鑒定具有宿主特異性的RNA2區域，Ito等[22]根據RNA2的不同核苷酸區域設計了嵌合病毒的進一步實驗。實驗采用構建的SJNNV和RGNNV的RNA2嵌合病毒分別感染它們的原始宿主魚，來測試它們的傳染性。實驗發現保留了RNA2 T4區的嵌合病毒可以感染原始宿主，結果表明T4區具備控制宿主特異性的作用，也是決定基因RNA2的致病區域。

2.3NNV引起的細胞凋亡

病毒在入侵宿主細胞后為了達到增加病毒傳播或破壞宿主原有免疫反應的目的，會通過多種途徑誘導宿主細胞或免疫細胞凋亡。在NNV病毒誘導的凋亡機制中，由線粒體介導的宿主細胞凋亡壞死最為常見。另外，內質網通路也參與介導細胞凋亡。

2.3.1線粒體介導的細胞凋亡線粒體介導細胞凋亡的途徑主要通過B2蛋白對Bcl-2蛋白家族的調節和觸發氧化應激來實現，RNA2和其編碼的衣殼蛋白也在引起線粒體介導的細胞凋亡中發揮了重要的作用。

由抗凋亡因子（Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和A1等）和促凋亡因子（Bax、Bak、Bid和Bad等）共同構成的Bcl-2蛋白家族是調節細胞凋亡的關鍵因素，兩種組成成分的比值決定細胞是否對近期凋亡刺激做出應答[23]。Bcl-2家族主要作用于線粒體外膜，維持線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）平衡和線粒體通透性轉變孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的正常開放。在病毒感染的中后期，促凋亡因子Bax的表達量上調至原來的2.8倍，誘導MMP的丟失，并觸發由線粒體介導的細胞凋亡[24]。研究發現，NNV的B2蛋白能通過特定的氨基酸信號41-50靶向結合線粒體，觸發由活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量產生引起的氧化應激[25]，同時抑制線粒體復合物Ⅱ的產生導致ATP能量耗竭[26]。氧化應激產生的ROS最終通過改變線粒體形態和誘導MMP的丟失介導細胞死亡。B2蛋白靶向結合線粒體產生H2O2，誘導線粒體分裂因子Drp1從胞漿轉移到線粒體上引起線粒體斷裂和細胞死亡[27]。

RNA2編碼病毒的衣殼蛋白在細胞凋亡以及細胞凋亡后壞死的過程中發揮了不可或缺的作用。RNA2誘導凋亡的早期引起磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外化[28]，中期引起細胞色素c（cytochrome c）的釋放和MMP丟失[29]。后期大量產生用于病毒組裝的衣殼蛋白，激活caspase家族的caspase-8和-3誘導宿主凋亡途徑，最終導致細胞溶解和死亡[30-32]。細胞溶解有助于完成病毒脫落，完成病毒的生命周期。

2.3.2內質網介導的細胞凋亡病毒在復制的早期和中期會觸發機體內質網應激反應。主要通過以下幾種途徑：ATF6和IRE1傳感器被激活，隨后上調伴侶蛋白BiP和GRP78[33];與下調的Bcl-2相關的PERK傳感器被磷酸化和caspase-12被激活。除此之外，GRP78可以與線粒體膜緊密連接的蛋白A結合，增加病毒在體內的復制。最后，因為MMP丟失和PERK介導的Bcl-2表達量的下調，引起線粒體功能障礙觸發壞死細胞死亡[34]。Lu等[35]證明了衣殼蛋白的過度表達也會觸發ER的應激反應。在被感染的細胞的細胞核中，發現了病毒的衣殼蛋白。同時，BiP蛋白作為內質網的重要分子伴侶，在感染的GF-1細胞中與NNV衣殼蛋白共定位，這也可以證明BiP與病毒的衣殼蛋白之間存在一定關系。在一定程度上能夠說明病毒的衣殼蛋白對引起內質網應激也存在一定作用，具體的過程仍需要深入探究。

2.3.3抑制細胞凋亡的機制宿主細胞為病毒提供了良好的復制空間，為了在宿主中更多的積累，病毒也會發揮抑制細胞凋亡的作用。許多病毒都能保護受感染的細胞抵抗早期壞死，它們可以通過抑制凋亡反應途徑中的各種步驟來實現。在NNV感染的早期，B1蛋白通過阻礙MMP的喪失等過程提高受感染細胞的活力，幫助其對抗早期的細胞壞死并為病毒的復制提供條件，在宿主細胞的抗壞死的過程中發揮重要作用[36]。

2.4NNV的免疫逃避機制

免疫逃避是誘導免疫和阻礙免疫兩者之間處于平衡狀態的結果，在石斑魚中發現NNV持續感染的情況，這被認為是病毒在發揮免疫逃避作用[37]。NNV主要依靠B2蛋白與宿主RNA進行對抗來執行免疫逃避[38]。NNV的B2蛋白能夠結合病毒的RNA，從而避免Dicer酶的切割，阻斷宿主RNA干擾，并且有助于病毒RNA1在宿主細胞中的不斷積累[39]。

3展望

NNV目前依舊沒有有效的治療措施，但通過對NNV病毒致病機制的討論，可以設計一些針對其致病性的治療措施。由線粒體介導的凋亡過程可以被Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白有效抑制，比如BclxL的過表達顯著阻斷由RGNNV死亡因子蛋白α和B2誘導的細胞死亡。這可以說明，抗凋亡蛋白具有治療由NNV感染引起的疾病的潛力。除此之外，線粒體毒素BKA作為MPTP的抑制劑也參與調節凋亡的過程。它的治療發生在感染的早期和中期，能夠顯著抑制MMP的丟失從而增強宿主細胞的活力、阻止線粒體細胞色素c的釋放。

對NNV致病機理的深入探究可以幫助我們了解病毒與宿主之間的關系，進而更好地預防和治療NNV。目前，對NNV復制機制、病毒檢測等方面的內容研究相對透徹，但是在破譯病毒復制過程中抑制和誘導細胞凋亡的機制、病毒RNA基因組在感染各個時期的致病機制和調控、闡明病毒的組裝和病毒基因組包裝以及成年魚類宿主中的病毒無癥狀攜帶和潛伏期等方面，仍有許多工作要做。

參考文獻：

[1] GLAZEBROOK J S，HEASMAN M P，DE BEER S W.Picorna-like viral particles associated with mass mortalities in larval barramundi，Lates calcarifer Bloch[J].Journal of Fish Diseases，1990，13（3）：245-249.

[2] YOSHIKOSHI K，INOUE K.Viral nervous necrosis in hatchery-reared larvae and juveniles of Japanese parrotfish，Oplegnathus fasciatus （Temminck & Schlegel）[J].Journal of Fish Diseases，1990，13（1）：69-77.

[3] 陳信忠，龔艷清.魚類病毒性神經壞死病研究進展[J].生物技術通報，2006（S1）：141-146.

[4] 陳曉艷.魚類病毒性神經壞死病研究現狀[J].動物醫學進展，2005（5）：17-21.

[5] BITCHAVA K，CHASSALEVRIS T，LAMPOU E，et al.Occurrence and molecular characterization of betanodaviruses in fish and invertebrates of the Greek territorial waters[J].Journal of Fish Diseases，2019，42（12）：1-11.

[6] BANDIN I，SOUTO S.Betanodavirus and VER Disease： A 30-year Research Review[J].Pathogens，2020，9（2）：1-49.

[7] GUO Y X，CHAN S W，KWANG J.Membrane association of greasy grouper nervous necrosis virus protein A and characterization of its mitochondrial localization targeting signal[J].Journal of virology，2004，78（12）：6498-6508.

[8] Kim J O.Intracellular signaling pathway for host defense mechanisms against Piscine Nervous Necrosis Virus （NNV）[J].Journal of Life Science，2020，30（4）：402-409.

[9] 陳文捷，劉曉丹，胡先勤，等.魚類神經壞死病毒研究進展與發展趨勢[J].水產學報，2014，38（9）：1666-1672.

[10] 魏盟智，李亞軍，安鑫龍，等.石斑魚病毒性神經壞死病防治的研究現狀[J].河北漁業，2020（5）：51-53.

[11] SOUTO S，OLVEIRA J G，DOPAZO C P，et al.Modification of betanodavirus virulence by substitutions in the 3' terminal region of RNA2[J].Journal of General Virology，2018，99（9）：1210-1220.

[12] 粟子丹，李晉，史成銀.引起半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）魚苗大規模死亡的神經壞死病毒病[J].漁業科學進展，2016，37（4）：110-115.

[13] CHEN N C，YOSHIMURA M，GUAN H H，et al.Crystal structures of a piscine betanodavirus： Mechanisms of capsid assembly and viral infection[J].PLOS Pathogens，2015，11（10） ：e1005203.

[14] MUNDAY B L，LANGDON J S，HYATT A，et al.Mass mortality associated with a viral-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundi，Lates calcarifer Bloch[J].Aquaculture，1992，103（3-4）：197-211.

[15] NISHIZAWA T，FURUHASHI M，NAGAI T，et al.Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene[J].Applied and environmental microbiology，1997，63（4）：1633-1636.

[16] LAMPERT Y，BERZAK R，DAVIDOVICH N，et al.Indigenous versus Lessepsian Hosts： Nervous Necrosis Virus （NNV） in Eastern Mediterranean Sea Fish[J].Viruses，2020，12（4）：1-9.

[17] 劉葒，史秀杰，高隆英，等.魚病毒性神經壞死病病毒（VNNV）不同基因型鑒別方法的建立及在VNN檢疫和監測中的應用[J].水產學報，2004，28（6）：695-702.

[18] JOHANSEN R，SOMMERSET I，TRUD B，et al.Characterization of nodavirus and viral encephalopathy and retinopathy in farmed turbot，Scophthalmus maximus （L.）[J].Journal of Fish Diseases，2004，27（10）：591-601.

[19] LIU W T，HSU C H，HONG Y R，et al.Early endocytosis pathways in SSN-1 cells infected by dragon grouper nervous necrosis virus[J].Journal of General Virology，2005，86（9）：1107-1114.

[20] CHANG J S，CHI S C.GHSC70 is involved in the cellular entry of nervous necrosis virus[J].Journal of virology，2015，89（1）：61-70.

[21] IWAMOTO T，OKINAKA Y，MISE K，et al.Identification of host-specificity determinants in betanodaviruses by using reassortants between striped jack nervous necrosis virus and sevenband grouper nervous necrosis virus[J].Journal of virology，2004，78（3）：1256-1262.

[22] ITO Y，OKINAKA Y，MORI K，et al.Variable region of betanodavirus RNA2 is sufficient to determine host specificity[J].Diseases of aquatic organisms，2008，79（3）：199-205.

[23] 梁凱，曹秉振.線粒體調控的細胞凋亡研究進展[J].生物醫學工程與臨床，2014，18（5）：501-505.

[24] SU Y C，WU J L，HONG J R.Betanodavirus non-structural protein B2： A novel necrotic death factor that induces mitochondria-mediated cell death in fish cells[J].Virology，2009，385（1）：143-154.

[25] CHANG C W，SU Y C，HER G M，et al.Betanodavirus induces oxidative stress-mediated cell death that prevented by anti-oxidants and zfcatalase in fish cells[J].Plos One，2011，6（10）：e25853.

[26] SU Y C，HONG J R.Betanodavirus B2 causes ATP depletion-induced cell death via mitochondrial targeting and complex II inhibition in vitro and in vivo[J].The Journal of biological chemistry，2010，285（51）：39801-39810.

[27] SU Y C，CHIU H W，HUNG J C，et al.Betanodavirus B2 protein induces hydrogen peroxide production，leading to Drp1-recruited mitochondrial fragmentation and cell death via mitochondrial targeting[J].Apoptosis，2014，19（10）：1457-1470.

[28] CHEN S P，YANG H L，HER G M，et al.Betanodavirus induces phosphatidylserine exposure and loss of mitochondrial membrane potential in secondary necrotic cells，both of which are blocked by bongkrekic acid[J].Virology，2006，347（2）：379-391.

[29] WU H C，CHIU C，WU J L，et al.Zebrafish anti-apoptotic protein zfBcl-x L can block betanodavirus protein a-induced mitochondria-mediated secondary necrosis cell death[J].Fish and Shellfish Immunology，2008，24（4）：436-449.

[30] MAO M G，JIANG J L，JIANG Z Q，et al.Molecular characterization of caspase members and expression response to Nervous Necrosis Virus outbreak in Pacific cod[J].Fish and Shellfish Immunology，2018，74：559-566.

[31] LOW C F，NATAQAIN B S，CHEE H Y，et al.Betanodavirus： Dissection of the viral life cycle[J].Journal of fish diseases，2017，40（11）：1489-1496.

[32] GUO Y X，WEI T，DALLMANN K，et al.Induction of caspase-dependent apoptosis by betanodaviruses GGNNV and demonstration of protein α as an apoptosis inducer[J].Virology，2003，308（1）：74-82.

[33] OYADOMARI S，MORI M.Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J].Cell Death & Differentiation，2004，11（4）：381-389.

[34] SU Y C，WU J L，HONG J R.Betanodavirus up-regulates chaperone GRP78 via ER stress： roles of GRP78 in viral replication and host mitochondria-mediated cell death[J].Apoptosis，2011，16（3）：272-287.

[35] LU M W，NGOU F H，CHAO Y M，et al.Transcriptome characterization and gene expression of Epinephelus spp in endoplasmic reticulum stress-related pathway during betanodavirus infection in vitro[J].BMC Genomics，2012，13（1）：1-12.

[36]? CHEN L J，SU Y C，HONG J R.Betanodavirus non-structural protein B1： A novel anti-necrotic death factor that modulates cell death in early replication cycle in fish cells[J].Virology，2009，385（2）：444-454.

[37] CHEN Y M，WANG T Y，CHEN T Y.Immunity to betanodavirus infections of marine fish[J].Pergamon，2014，43（2）174-183.

[38] FENNER B J，THIAGARAJAN R，CHUA H K，et al.Betanodavirus B2 is an RNA interference antagonist that facilitates intracellular viral RNA accumulation[J].Journal of virology，2006，80（1） ：85-94.

[39] FENNER B J，GOH W，KWANG J.Sequestration and protection of double-stranded RNA by the betanodavirus b2 protein[J].Journal of virology，2006，80（1）：85-94.

Research progress on pathogenic mechanism of nevous necrosis virus in marine fish

ZHU Yumin1，LIU Hong2，MAO Mingguang1

（1.Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North Chinas Sea，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Fish

Applied Biology and Aquaculture in North China，Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China;2.Shenzhen

Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen 518045，China;3. Key laboratory of Utilization

and Conservation for Tropical Marine Bioresources，Ministry of Education， Hainan Tropical Ocean University， Sanya 572022，China）

Abstract：Nerve necrosis virus （NNV） is mainly distributed in the Mediterranean Sea and the west coast of the Pacific Ocean.It has been detected in more than 120 species of fish.It can cause viral nerve necrosis （VNN） in fish and is one of the most harmful pathogens to marine fish.At present，with the in-depth study of gene sequence，type，diagnosis and prevention technology of nerve necrosis virus，more and more reports about its pathogenic mechanism were reported.This paper summarized the research status of virus attachment，pathogenic genes，apoptosis and immune evasion.

Key words：nerve necrosis virus;pathogenesis;immune evasion;apoptosis

（收稿日期：2021-05-06）

基金項目：大連市支持高層次人才創新創業項目（2019RQ121）;國家自然科學基金（31302202）;遼寧省教育廳項目（JL201902）;中國博士后基金（2016M602391）。

作者簡介：朱裕敏（1998-），女，在讀碩士研究生，研究方向：水產醫學。E-mail：1277756179@qq.com。

通信作者：毛明光（1982-），男，副教授，研究方向：海洋生物學。E-mail： 41810096@ qq.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2021.06.006