右美托咪定混合氯胺酮對新生大鼠離體海馬細胞凋亡的影響

吳新海+趙中保+莫麗賢

【摘要】 目的 探討右美托咪定（Dex）混合氯胺酮對新生大鼠離體海馬細胞凋亡的影響。方法 SD新生大鼠（出生7 d）海馬神經元體外培養6 d， 采用隨機數字表法分為對照組（C組）， 100 μmol/L氯胺酮組（K組）， 10 μg/ml Dex組（D組）， 10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮組（DK組）， 各6只。孵育24 h后采用免疫組化法檢測Caspase-3蛋白的表達， 雙染法檢測神經元凋亡。結果 與C組比較， K組的海馬細胞凋亡率和Caspase-3表達水平升高（P<0.05）；與C組比較， D組海馬細胞凋亡率和Caspase-3表達水平差異無統計學意義（P>0.05）；與K組比較， DK組和D組的海馬細胞凋亡率和Caspase-3表達水平降低（P<0.05）。結論 Dex能減輕氯胺酮誘導的新生大鼠離體海馬細胞凋亡。

【關鍵詞】 右美托咪定；氯胺酮；海馬細胞；凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.14.210

Influence by dexmedetomidine mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats WU Xin-hai， ZHAO Zhong-bao， MO Li-xian. Department of Anesthesiology， Beijing University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

【Abstract】 Objective To investigate influence by dexmedetomidine （Dex） mixed with ketamine on isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats. Methods Hippocampal neuron from SD infant rats （7 d after birth） were taken for 6-d culture in vitro， and they were randomly divided into control group （group C）， 100 μmol/L ketamine group （group K）， 10 μg/ml Dex group （group D）， and 10 μg/ml Dex mixed with 100 μmol/L ketamine group （group DK）， with 6 rats in each group. After 24 h of incubation， immunohistochemistry method was applied to detect expression of Caspase-3 protein， and double-staining method was used to detect neuronal apoptosis. Results Comparing with group C， group K and increased hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P<0.05）， and group D had no statistically significant difference of hippocampus cells apoptosis rate and Caspase-3 expression level （P>0.05）. Comparing with group K， groups KD and D had reduced hippocampus cells apoptosis rates and Caspase-3 expression levels （P<0.05）. Conclusion Dex can relieve ketamine-induced isolated hippocampus cells apoptosis from infant rats.

【Key words】 Dexmedetomidine； Ketamine； Hippocampus cells； Apoptosis

氯胺酮可改變發育中大鼠海馬神經元N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）的表達及谷氨酸的活化， 誘導海馬細胞變性和遠期認知功能的障礙[1， 2]。高選擇性的α2 受體激動劑Dex是高選擇性α2腎上腺素受體， 作用于中樞神經與周圍神經系統及其他器官組織的α2腎上腺素受體， 動物實驗證實Dex具有神經保護作用， 能減輕異氟烷導致的新生大鼠海馬細胞凋亡[3， 4]；而Dex與氯胺酮合用對新生大鼠海馬細胞凋亡的影響尚不清楚。現將本院研究結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 實驗材料：清潔級出生7 d的雄性SD大鼠（北京大學深圳醫院實驗動物中心提供）， 體重10～16 g。鹽酸氯胺酮（上海制藥一廠）， Dex（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）， DMEM/F-12（Sigma）， B27（Gibi-co）， 胎牛血清（杭州四季青）， Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）， Caspase-3免疫組化試劑盒（江蘇海門碧云天技術研究所）， 激活型caspase-3單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）， β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。實驗用儀器：CO2恒溫細胞培養箱， 流式細胞儀（BD公司）， 倒置相差顯微鏡（日本Olympus）， 高速低溫離心機。

1. 2 方法

1. 2. 1 海馬神經元培養 取新生7 d內的SD大鼠在無菌環境中， 剪開皮膚和顱骨， 取腦組織置預冷D-Hank S液的培養皿中， 在顯微鏡下取海馬。將海馬移至另一預冷HBSS液的培養皿中剪碎， 將海馬移至另一預冷HBSS液的培養皿中剪碎， 加入胰蛋白酶， 加入等量HBSS液， 置37℃ 、5% CO2 培養箱消化15 min。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12終止反應， 吹散為單細胞懸液， 靜置后取上清液， 約1000 r/min離心5 min， 棄上清細胞計數后， 用含2% B27、EGF、bFGF培養基稀釋使細胞數為5×105個/ml， 以100 μl接種于96孔培養板中， 37℃ 、5%CO2 培養箱中培養， 24 h后全量換液， 48 h后加入終濃度為10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h更換新培養液， 以后每2天半量換液， 培養6 d用于實驗。

1. 2. 2 實驗分組 將對數生長期的新生大鼠海馬神經元隨機分為對照組（C組）；100 μmol/L氯胺酮組（K組）；10 μg/ml Dex組（D組）；10 μg/ml Dex 混合100 μmol/L氯胺酮組（DK組）。每組設6個平行樣。將各組細胞置于37℃、5% CO2 培養箱培養24 h。

1. 2. 3 海馬細胞凋亡率的流式細胞儀檢測 培養的海馬細胞收集到10 ml的離心管中， 每樣本細胞數為5×106， 1000 r/min離心5 min棄培養液。PBS洗1次， 1000 r/min離心5 min。用5 μl的Annexin V重懸細胞， 室溫下避光孵育15 min， 1000 r/min離心5 min沉淀細胞， PBS液洗1次， 加入5 μl的PI 4℃下孵育20 min， 避光并不時震蕩。上流式細胞儀檢測海馬細胞凋亡率。

1. 2. 4 海馬細胞caspase-3陽性表達的檢測 6孔培養板中的細胞接種于蓋玻片， 免疫細胞化學染色法固定， 參照說明書操作， 細胞核著深褐色即為陽性細胞， 光鏡下隨機取5個視野， 計算平均陽性細胞數反映caspase-3蛋白的表達水平。

1. 3 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

與C組比較， K組的海馬細胞凋亡率和caspase-3蛋白表達水平升高（P<0.05）；與C組比較， D組海馬細胞凋亡率和caspase-3蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）；與K組比較， DK組和D組的海馬細胞凋亡率和caspase-3蛋白表達水平降低（P<0.05）。見表1。

3 討論

NMDA受體參與中樞神經系統發育過程的調控， 調節興奮性突觸傳遞和發育過程中突觸可塑性， 與神經元生長、分化、遷移和功能修飾密切相關， 并參與學習記憶的形成[5， 6]。NMDA受體拮抗劑氯胺酮， 可以阻斷神經遞質谷氨酸和NMDA受體的結合， 動物實驗證實大量使用氯胺酮可導致新生大鼠神經系統發育和功能的異常[7]。實驗證實， 氯胺酮可使體外培養的新生大鼠海馬細胞的凋亡率增加以及caspase-3蛋白表達增加；caspase-3是所有細胞凋亡途徑的最后效應子， 哺乳動物神經元的凋亡可高表達caspase-3 ， 因此檢測caspase-3的表達可反映神經元凋亡程度。

Dex作用于中樞神經與周圍神經系統及其他器官組織的α2腎上腺素受體， 具有鎮靜、鎮痛、抑制交感神經活性的效應， 常用作臨床麻醉輔助用藥[1， 2]。動物實驗證實Dex具有神經保護作用， 不僅能減輕缺血性大鼠腦細胞損傷[3]， 還能減輕異氟烷導致的新生大鼠海馬細胞凋亡[4]。前期研究也發現Dex證實減輕七氟烷誘導的新生大鼠遠期認知功能的障礙[8]。在本研究中， 發現Dex不影響新生大鼠離體培養的海馬細胞的凋亡， 但是混合氯胺酮能減輕其誘導的新生大鼠離體海馬細胞的凋亡。Dex對于吸入麻醉劑和氯胺酮誘發的發育中大鼠腦細胞損傷的保護作用的機制尚不清楚， 有研究認為Dex神經保護機制可能通過降低循環中及腦細胞外的兒茶酚胺濃度、抑制鈣離子內流和興奮性氨基酸的釋放、激活Akt或ERK等細胞生存信號通道， 調節凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡[9]。

參考文獻

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[8]吳新海， 鄧若熹， 張燕. 右美托咪定減輕七氟醚誘導的新生大鼠海馬細胞凋亡和遠期認知障礙. 國際麻醉學與復蘇雜志， 2015， 36（9）：782-786.

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[收稿日期：2016-01-21]