雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響

黃鳳霞　賀紅艷　黃君華　李小峰　張淑莉　王影

【摘 要】目的：探討雷帕霉素（RAPA）對(duì)人慢性髓系白血病K562細(xì)胞株增殖和凋亡作用的影響。方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，用不同濃度的雷帕霉素（25、50、100nmol/L）處理K562細(xì)胞24、48、72h后收集細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)處理組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，100nmol/L雷帕霉素處理72h后抑制率高達(dá)48%，且呈濃度和時(shí)間雙重依賴性，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.691，p<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)25、50、100nmol/L雷帕霉素作用24h后，K562細(xì)胞早期凋亡率分別為13.12±0.32，18.56±0.12，25.95±0.16，均較對(duì)照組明顯增高，48h、72h細(xì)胞凋亡率明顯增高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.900，t=14.640，t=16.830，p<0.05）。結(jié)論：雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】雷帕霉素；K562細(xì)胞；增殖；凋亡

慢性粒細(xì)胞白血病是一種起源于造血干細(xì)胞的疾病，其特征是具有Ph染色體在分子形式形成BCR/ABL融合基因。[1]它的治療受到科學(xué)界的廣泛重視，雷帕霉素（RAPA）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抑制劑，已作為抗真菌藥、免疫抑制劑應(yīng)用于臨床[2]。研究證實(shí)雷帕霉素具有抗腫瘤作用，如抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及其血管生長(zhǎng)[3]、誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡[4]等。研究報(bào)道雷帕霉素在HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞[5]、A549肺癌細(xì)胞[6]、HepG-2肝癌細(xì)胞[7]等多種惡性腫瘤細(xì)胞中有較強(qiáng)的抑制作用。

有研究顯示雷帕霉素抑制膀胱癌5637細(xì)胞增殖同時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。對(duì)于RAPA抗惡性血液腫瘤作用的機(jī)制研究報(bào)道不多。本研究以人慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞為研究對(duì)象，分析雷帕霉素對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株的增殖及細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療慢性粒細(xì)胞白血病找到新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人慢性髓性白血病K562細(xì)胞細(xì)胞株（陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科中心實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 主要試劑

雷帕霉素（美國(guó)LC公司）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自上海生工公司、RPMI-1640（Gibco公司）、Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色試劑盒（晶美公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人慢性髓性白血病K562細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10g/dl胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，并加入含1g/dl青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度為5ml/dlCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，接種于96孔無菌培養(yǎng)板中，分別用25、50、100nmol/L雷帕霉素處理K562細(xì)胞，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞置于37℃、5ml/dl CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h、48h和72h后，然后加入10μlMTT孵育4h，將孵育后培養(yǎng)板取出，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μlDMSO，于搖床上振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。以調(diào)零孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，按照如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔A490/對(duì)照孔A490）×100%。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，分別用25、50、100nmol/L雷帕霉素處理K562細(xì)胞，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞置于37℃、5ml/dlCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h、48h和72h后，4℃預(yù)冷PBS洗1次，棄上清，用100μl鈣緩沖液重懸細(xì)胞，加AnnexinV-FITC10μl和PI5μl，室溫孵育15min，加鈣緩沖液300μl。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用■±S表示，均數(shù)的兩兩比較用t檢驗(yàn)，p<0.05有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素抑制K562細(xì)胞增殖抑制作用：

不同濃度雷帕霉素處理K562細(xì)胞24h、48h和72h后，隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)K562細(xì)胞抑制作用逐漸增加，細(xì)胞增殖抑制率增高，見表1。雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間雙重依賴性，與對(duì)照組比較有明顯差異（p<0.05）。

2.2 雷帕霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，25，50，100nmol/L的雷帕霉素作用于K562細(xì)胞，作用24h，48h，72h后細(xì)胞凋亡率均較空白對(duì)照組顯著增加（p<0.05），（表2）表明具有劑量依賴性，因此雷帕霉素處理組可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病（CML）是起源于造血干細(xì)胞的克隆性增殖性疾病，目前研究在探索治療慢性粒細(xì)胞白血病的機(jī)制及其新方法，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡是治療白血病的必要手段。研究表明，mTOR通路抑制劑可以使細(xì)胞周期阻滯在G1期，并可進(jìn)一步促進(jìn)線粒體損傷途徑，產(chǎn)生自噬及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。雷帕霉素是一種強(qiáng)有效的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其主要作用位點(diǎn)在mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路，靶向mTOR信號(hào)通路是治療腫瘤的一個(gè)新的方向，目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用雷帕霉素治療腎細(xì)胞癌，在惡性血液疾病研究當(dāng)中逐漸開始關(guān)注，探索雷帕霉素在慢性粒細(xì)胞白血病的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

采用MTT法檢測(cè)不同濃度雷帕霉素處理K562細(xì)胞24h、48h、72h后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，結(jié)果顯示，雷帕霉素處理K562細(xì)胞增殖明顯被抑制，并呈時(shí)間和劑量依賴性。增殖抑制率與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），表明雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以抑制K562細(xì)胞中的mTOR的活性，已有研究顯示，雷帕霉素對(duì)白血病細(xì)胞HL-60、SUP-B15細(xì)胞具有較強(qiáng)抑制作用，因而，證實(shí)雷帕霉素抑制K562細(xì)胞的增殖，可以為慢性粒細(xì)胞白血病聯(lián)合用藥治療提供新的治療方案。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞的早期凋亡率，結(jié)果顯示，作用K562細(xì)胞24h后，早期凋亡率分別是15.19±0.32，

21.56±0.12，25.95±0.16，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），雷帕霉素使得大量K562細(xì)胞停滯于G0/G1期，不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA的合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，雷帕霉素可通過抑制mTOR信號(hào)，從而導(dǎo)致造血干細(xì)胞發(fā)育分化進(jìn)程被抑制，阻止細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變[10]，提示雷帕霉素明顯抑制K562細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯：王楠]