靈芝多糖對HepG2細胞誘導的肝癌小鼠腸道菌群及其菌群代謝功能的調節作用*

于 雷，孫 超，張曼旭

人類各種疾病，包括各種代謝性疾病、腸道疾病、癌癥和自身免疫性疾病等均與腸道微生物失調緊密相關，其中肝臟疾病的關聯性尤為顯著[1]。很多學者[2，3]研究發現肝細胞癌、肝硬化和非酒精性脂肪性肝病等患者體內存在腸道菌種及其代謝的紊亂狀態。肝癌作為臨床上高發性惡性腫瘤之一，不僅嚴重影響人類的生存質量和生命健康，同時對社會和家庭經濟帶來沉重的負擔[4]。近幾年來，很多中醫藥研究機構試圖嘗試研發輔助藥物以幫助治療肝癌患者，例如靈芝三萜和加味柴苓湯等[5，6]。靈芝多糖(ganoderma lucidum plysaceharide，GLP)是從靈芝中提取的一種主要活性組分。藥理學研究揭示GLP在調節免疫功能、抗癌、抗氧化、抗衰老和抗輻射等方面起著至關重要的作用[7]。以往研究[8]主要圍繞GLP對肝癌小鼠腸道粘膜免疫功能的影響或肝癌細胞增殖和遷移的影響等。本研究采用HepG2細胞構建小鼠肝癌模型，并初步探討了GLP對其腸道菌群及其菌群代謝功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、藥品和試劑 SPF級昆明小鼠，體質量為(17.5±2.2)g，購自武漢大學實驗動物資源中心(動物合格證號為16054418)。飼養在24～26℃，相對濕度為53～55%的室內，通風換氣10次/h，光照12 h，黑暗12 h，自由獲取食物和水；HepG2肝癌細胞株由中國醫學科學院腫瘤細胞庫提供。培養方法：從液氮罐中取出HepG2細胞、復蘇，用DMEM(含10%胎牛血清)培養基，在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，待細胞呈對數生長期時終止培養，1200 r/m離心10 min，棄去上清液，再用DMEM(含10%胎牛血清)重懸細胞，制成2×105個/mL的細胞懸液，備用；GLP由西安明澤生物科技股份有限公司提供。益生菌由輝凌公司提供，用前稀釋至50%濃度。精提基因組DNA裂解液：50 mmol/L Tris-HCL、50 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl、4% EDTA，將pH調至8.0。應用上下游引物(上海生物工程公司)擴增細菌16 s rRNA V3可變區。

1.2 肝癌小鼠模型的建立 用注射器取上述HepG2細胞懸液200μL，注射至小鼠右腋下部位，密切觀察小鼠皮下成瘤情況。當出現可見瘤體時，表示造模初步成功。然后，每周測量腫瘤結節直徑。當達到1cm時，表示造模成功，用于后續實驗。本次總共成功構建肝癌模型小鼠21只。

1.3干預與分組 將上述造模成功的肝癌小鼠隨機分為模型組、GLP組和益生菌組，每組7只。另隨機選擇7只正常小鼠作為對照組。GLP和益生菌用量參照臨床上成人的用藥劑量，采取人體-小鼠體表面積比值折算后應用2倍量，灌胃；在模型組和對照組，給予等量的生理鹽水，灌胃，1次/d，連續干預2 w。

1.4 小鼠腸道菌群組成結構檢測 鏡檢法：采用頸椎或尾椎脫臼法處死小鼠，剝離皮下腫瘤組織，分離小腸，嚴格按照無菌操作取出一定量的腸道內容物，于含有玻璃珠和滅菌蒸餾水的三角瓶內，于搖床上120 r/m震蕩30 min，以利于各類微生物充分分散。采用混菌法和涂布法將上述菌液以適宜的稀釋比例接種于相應培養基，置于37℃培養箱培養24～48 h。取出培養液，于顯微鏡下觀察，計數腸道內容物的菌群豐度。以每克腸道內容物含特定類型細菌數表示，每個稀釋度重復檢測3次；變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)：取小鼠糞便，置于干凈的2 mL無菌EP管中，添加一定量的鎬珠，加入精提基因組DNA裂解液700μL，吹打、充分混勻，再將苯酚/氯仿/異戊醇以25/24/1比例加入250μL并混勻。在旋渦震蕩儀上震蕩3 min，12000 r/m離心5 min，取上清于新的無菌EP管中，加入10 mol/L乙酸銨700μL，冰上放置5 min，12000 r/m離心10 min，取上清并再次用苯酚/氯仿/異戊醇抽提2次，氯仿抽提2次，再加入異丙醇并置于-20℃冰箱30 min，使DNA沉淀。離心并棄掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，最后用雙蒸水50μL溶解DNA，備用；PCR擴增16 s rRNA V3可變區。PCR反應體系：Taq DNA聚合酶12.5μL、10μM F 0.5μL、10μM R 0.5μL、DNA模板1.0μL，ddH2O補足至25μL。PCR反應條件采用Touch down程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸70 s，共20個循環，每個循環退火溫度依次降低0.5℃，溫度遞降范圍為65～56℃，最后以56℃退火溫度循環10次；配制濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度范圍為30%～58%。將上述DNA擴增產物上樣，并置于1×TAE緩沖液中電泳，電泳條件：電壓220 v，預電泳5 min，60℃、電壓85 v電泳16 h；硝酸銀染色、拍照，應用Quantity One軟件分析；DGGE指紋圖譜分析。應用相似性聚類分析法將DGGE膠通過掃描儀輸入到電腦，再應用Molecular Analysis軟件分析各細菌序列相似性，每一個條帶表示特定菌種，然后通過序列比對分析和計算得出菌種豐富度、多樣性指數和均勻度。

1.5 小鼠腸道菌群脂肪酸代謝產物檢測 于干預后2 w收集各組小鼠糞便，采用氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸)水平；采用Megazyme D-乳酸定量檢測試劑盒測定D-乳酸含量。

2 結果

2.1 四組小鼠腸道菌群比較 GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數量顯著低于模型組(P<0.05)；模型組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數量顯著高于對照組(P<0.05)；但GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數量與對照組基本一致(P>0.05，表1)。

表1 四組小鼠腸道菌群比較

2.2 四組小鼠糞便DGGE圖譜指標比較 GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數和均勻度較顯著高于模型組(P<0.05)；模型組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數和均勻度均顯著低于對照組(P<0.05，表2)。

表2 四組小鼠糞便DGGE圖譜指標比較

2.3 四組小鼠菌群代謝功能指標比較 GLP組、益生菌組小鼠腸道菌群代謝產物短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸均顯著高于模型組(P<0.05)，D-乳酸顯著低于模型組(P<0.05)；模型組乙酸、丙酸、正丁酸均顯著低于對照組(P<0.05)，D-乳酸顯著高于對照組(P<0.05)；GLP組、益生菌組小鼠腸道菌群代謝產物短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸、D-乳酸與對照組基本一致(P>0.05，表3)。

表3 四組小鼠腸道菌群代謝產物水平比較

3 討論

腸道菌群失調指的是腸道內菌群結構發生劇烈的改變，益生菌數量急劇下降，同時伴隨有害細菌的肆意滋生，使腸道代謝功能紊亂[9-11]。本研究結果顯示，肝癌模型小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數量較對照組均顯著升高，表明肝癌的形成改變了小鼠腸道菌群的種類和數量。在干預后，GLP組和益生菌處理組小鼠腸道上述菌群數量較模型組均顯著減少，且接近對照組水平，表明GLP干預可以降低肝癌小鼠體內雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌數量，有利于維持腸道菌群的平衡。益生菌是目前臨床上廣泛使用的有益活性微生物，可用于改善腸道功能，幫助營養物質的消化和吸收[12-16]。DGGE分析結果顯示GLP處理組和益生菌處理組小鼠腸道菌群豐富度、多樣性指數和均勻度較模型組均顯著升高，進一步驗證了GLP參與調控肝癌小鼠腸道的微生態失衡，其作用與益生菌相當。

短鏈脂肪酸，諸如乙酸、丙酸和正丁酸，為機體腸道菌群獨有的經典重要代謝產物，這些指標可以從側面揭示腸道內厭氧性菌群代謝的功能狀態[17]。本研究結果發現，GLP處理組和益生菌處理組腸道乙酸、丙酸、正丁酸水平較模型組均顯著升高，且接近對照組小鼠水平，表明GLP干預有利于肝癌小鼠腸道菌群代謝功能的恢復，改善機體代謝紊亂狀態，其機制與調節機體腸道菌群平衡密切相關[18]。D-乳酸是衡量腸道菌群增殖能力的指標，可用于指示腸道細菌增殖程度[19]。GLP處理組和益生菌處理組腸道D-乳酸較模型組均顯著降低，表明GLP和益生菌處理均能夠降低與D-乳酸代謝相關的有害細菌增殖，其機制可能與調控腸道內酸堿度、調控腸道粘膜免疫相關分子水平和抑制酪氨酸激酶信號轉導通路有關[20]。