慢性乙型肝炎患者血清內質網應激指標變化及其臨床意義*

吳 慧，宋 波，呂承秀，田文君，牛家峰

有報道顯示，HBV在肝細胞內的持續復制可引起內質網應激反應，并與肝細胞損傷和肝癌的發生等密切相關，但關于HBV誘導肝細胞內質網應激反應的機制尚不明確[1，2]。內質網屬哺乳動物細胞內新合成的蛋白質和肽鏈折疊和修飾及脂類和糖類合成的關鍵場所。當各種生理病理學因素誘發內質網穩態失衡時，會引起內質網腔內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的大量聚集，改變鈣離子濃度，最終誘發內質網應激[3，4]。外周血內質網應激相關指標，如葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、內質網應激轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)和天冬半胱氨酸特異性蛋白酶-12(caspase-12)等，均為反映內質網應激反應較為敏感的指標。以往報道顯示，內質網應激參與了肝纖維化的發生、發展或逆轉過程，但其在肝纖維化各階段中的作用機制尚未完全明確[5]。本研究檢測了CHB患者外周血內質網應激相關指標的變化，旨在為臨床診治提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年5月～2020年5月我院收治的CHB患者109例，男72例，女37例，年齡18～65歲，平均年齡為(38.5±12.4)歲；乙型肝炎肝硬化患者91例，男50例，女41例，年齡22～66歲，平均年齡為(42.9±14.1)歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]的診斷標準；原發性肝癌(primary liver cancer, PLC)患者76例，男40例，女36例；年齡32～70歲，平均年齡為(49.7±14.0)歲。符合《原發性肝癌診療規范(2011年版)》[7]診斷標準。排除標準：合并其他病毒感染、合并酒精性肝病、自身免疫性肝病、脂肪性肝病、代謝性肝病、藥物性肝損傷、上消化道大出血、精神疾病、妊娠或哺乳期婦女。另選擇健康志愿者120例，男65例，女55例，年齡23～68歲，平均年齡為(42.8±12.6)歲。所有納入人群簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會審批。

1.2 檢測方法 使用美國貝克曼庫爾特公司生產的DXC800型全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用放射免疫法檢測血清透明質酸(hyaluronic acid，HA)、層黏蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原肽(procollagen-Ⅲ-peptide，PⅢP)和Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)水平(杭州康拓生物科技有限公司；采用ELISA法檢測血清GRP78、CHOP和caspase-12水平(美國Proteintech公司試劑，美國Bio-Rad公司生產的I550型酶標儀)。

2 結果

2.1 四組肝功能指標比較 三組肝病患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平顯著高于健康人(P<0.05，表1)。

表1 四組肝功能指標比較

2.2 四組血清肝纖維化指標比較 三組肝病患者血清HA、LN、Ⅳ-C和PⅢP水平顯著高于健康人(P<0.05)，而肝硬化和肝癌患者血清肝纖維化指標顯著高于CHB患者(P<0.05，表2)。

表2 四組血清肝纖維化指標比較

2.3 四組血清內質網應激指標比較 三組肝病患者血清GRP78、CHOP和caspase-12水平顯著高于健康人，而肝硬化和肝癌組血清上述指標水平顯著高于CHB組(P<0.05，表3)。

表3 四組血清內質網應激指標比較

3 討論

CHB是由HBV感染導致的慢性肝臟炎癥性疾病，具有發病率高、病程長、難治愈、易反復等特點，發病機制尚未完全明確，主要涉及HBV感染和人體免疫應答系統。通常認為，HBV并無肝細胞毒性，但感染HBV后可刺激機體形成特異性抗體(體液免疫)和特異性致敏的淋巴細胞(細胞免疫)，誘發機體產生一系列免疫反應[8]。有報道認為，內質網應激可能參與多種肝臟疾病的發生、發展和轉歸，而HBV等病毒感染可引起肝細胞內質網應激反應，并與病毒復制和肝癌的發生等密切相關[9]。目前，關于內質網應激水平與CHB患者肝纖維化和肝損傷的關系，臨床相關報道較少。

HBV復制并不會誘發肝細胞損傷，而HBV抗原會促使人體免疫細胞被激活，攻擊表達HBV抗原的肝細胞，從而引起細胞凋亡，同時募集炎癥細胞浸潤，加重肝組織損傷[11]。另有報道認為，HBV感染后是否引起肝損傷取決于病毒與機體免疫的相互作用，而HBV免疫介導肝損傷機制主要包括固有免疫、T細胞免疫、抗體依賴細胞介導的細胞毒性[12]。HBV引起肝細胞損傷，其可能的機制包括以下方面：(1)HBV蛋白過度表達，引起肝細胞毛玻璃樣改變；(2)HBx基因編碼HBV x抗原，經與宿主間的相互作用，調節轉錄、細胞增殖、蛋白降解，引起肝細胞凋亡和壞死；(3)在caspase依賴途徑下HBV結合RNA編碼的HBV剪切蛋白直接引起肝細胞凋亡，或經免疫反應介導肝損傷。

本研究結果顯示，三組肝病患者血清HA、LN、Ⅳ-C和PⅢP水平均顯著升高，與既往報道[13]相符，提示CHB和乙型肝炎肝硬化患者均存在肝纖維化。有報道顯示， 約28%～37%血清ALT持續正常的CHB患者亦存在顯著的肝纖維化[14]。肝纖維化進程的中心環節，即肝星狀細胞激活和成纖維細胞活化、細胞外基質產生與降解失衡[15]。在自身免疫反應異常、病毒感染等因素的長期作用下，炎癥反復發作，致使肝組織過度修復，引起實質細胞再生和間質組織重建，導致調控細胞外基質產生與降解和細胞外基質降解與清除之間平衡喪失，引起結締組織過度沉積，血清HA、LN、PⅢP和Ⅳ-C水平顯著上升，最終誘發肝纖維化的形成。

本研究結果顯示，三組肝病患者血清GRP78、CHOP和caspase-12水平顯著升高，提示內質網應激確實參與了CHB和乙型肝炎肝硬化的發病。內質網應激參與CHB的發病過程，HBV感染可引起肝細胞內質網應激反應，并與肝細胞損傷和肝纖維化的出現密切相關[16]。GRP78屬細胞內質網應激標志性蛋白，可阻止內質網新生肽聚集，調節內質網鈣穩態，抗內質網相關性細胞凋亡；CHOP屬促凋亡因子，參與內質網應激誘導的細胞凋亡；caspase-12介導內質網應激誘導的細胞凋亡，屬內質網應激特有的凋亡途徑[17]。內質網應激能促使細胞內多條信號傳導通路被激活，早期經增強蛋白質折疊、誘導受損蛋白質降解、促使蛋白質合成減少等方式減輕內質網應激反應，促使細胞穩態的恢復。一旦肝細胞內質網應激反應持續時間過長，且內質網應激反應程度過強時，肝細胞可經內質網應激反應信號通路促使下游凋亡信號，如CHOP和caspase-12等的激活，誘導細胞凋亡[18，19]。有報道認為，內質網應激可能經調控內質網Ca2+ATP酶和Ca2+平衡，誘導肝損傷，同時伴隨著CHOP、GRP78和c-Jun氨基末端激酶水平的上升及細胞凋亡通路的激活，表明肝功能損傷和肝纖維化的發生伴隨著內質網應激的發生[20]。本研究發現CHB患者血清內質網應激指標升高，其臨床意義還有待探討。