慢性丙型肝炎患者血清microRNA-1273g-3p水平預測肝硬化價值分析*

王嘉妮，劉 湧，周 忻，任傳路，繆惠鍇

慢性丙型肝炎(CHC)患者肝細胞長期受損，約35.8%可能進展為肝硬化[1,2]。微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)為單鏈、內源性、非編碼RNA，由21～25個核苷酸組成，參與細胞增殖、分化等多個生物學過程，具有十分重要的作用[3，4]。微小核糖核酸-1273g-3p(microribonucleic acid-1273g-3p，microRNA-1273g-3p)水平與患者血清細胞因子水平及肝功能損傷緊密相關[5，6]。本研究檢測了CHC患者血清microRNA-1273g-3p水平變化，并探討了其預測肝硬化發生的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2018年3月～2020年8月我院收治的CHC患者125例，男74例，女51例；年齡為29～73歲，平均年齡為(54.3±9.1)歲；體質指數(body mass index，BMI)為19.5～26.8 kg/m2，平均為(23.8±6.5)kg/m2；CHC病程為5～13年，平均為(9.6±2.7)年。符合《慢性丙型肝炎防治指南》《肝硬化診治指南》[7，8]的診斷標準。排除標準：合并惡性腫瘤、藥物性肝損傷或酒精性肝病、合并其它肝炎病毒感染者。本研究經我院醫學倫理委員會批準同意，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 血清microRNA-1273g-3p水平檢測 采集外周靜脈血5 mL，4℃冷凍離心機12000 r/m離心10 min，分離血清。采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)法檢測血清microRNA-1273g-3p水平：采用Trizol法提取miRNA，在杭州奧盛儀器有限公司生產的Nano-500微量分光光度計上檢測RNA濃度和純度。采用Taqman miR逆轉錄試劑盒(北京華大蛋白質研發中心有限公司)，按說明書要求提取總miRNA，逆轉錄成cDNA。設計Nectin-4和內參基因β-actin上下游引物，Nectin-4上游引物：5’-CTCAGTTCAGGATCAATGCAT-3’，下游引物：5’-CAGTTACTACGTACATGACCT-3’，產物長度121 bp；β-actin上游引物：5’-ATCACGTATTGCTACTGAAC-3’，下游引物：5’-TCAGTACATGTACATGACAT-3’，產物長度113 bp；反應體系為20 μL：2×SYBR Mix 1 μL，10×cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，加H20 8 μL，每個樣品重復檢測3次。使用美國ABI公司生產的ABI-7300型熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應，反應條件：95℃，3 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；40個循環。根據2-△△Ct計算microRNA-1273g-3p相對水平。

2 結果

2.1 CHC患者肝硬化發生情況 經臨床、血生化和影像學檢查，在本組125例CHC患者中，發現肝硬化患者42例(33.6%)。

2.2 CHC患者發生肝硬化的單因素分析 經Logistic回歸分析，發現CHC發生肝硬化患者BMI、病程、輸血史、血脂異常、未抗病毒治療和血清microRNA-1273g-3p水平與CHC患者比，差異顯著(P<0.05，表1)；經Logistic多因素回歸分析發現上述因素均是CHC患者發生肝硬化的獨立危險因素(表2、表3)。

表1 兩組臨床資料比較

表2 影響CHC患者發生肝硬化的自變量賦值結果

表3 CHC患者發生肝硬化的多因素Logistic回歸分析

2.3 血清microRNA-1273g-3p水平預測CHC患者發生肝硬化的價值 經ROC分析顯示，以血清microRNA-1273g-3p水平1.56為最佳截斷點，其AUC值為0.844(95%CI：0.768～0.902)，預測CHC患者發生肝硬化的靈敏度為78.6%(33/42，95%CI：73.1%～83.2%)，特異度為86.8%(72/83，95%CI：82.5%～90.6%)，準確度為90.4%(113/125，95%CI：73.1%～83.2%，圖1)。

圖1 血清microRNA-1273g-3p水平預測CHC患者發生肝硬化的ROC曲線

3 討論

肝穿刺活檢為診斷肝硬化的金標準，其屬于有創檢查，且存在一定的局限性。相關研究顯示[9-12]，miRNA的異常表達與肝組織纖維化、炎癥因子抑制等有關，不同的miRNA在不同組織、細胞中所發揮的作用不同，同一miRNA在不同疾病中的表達也不同。故而，探討microRNA-1273g-3p對CHC患者發生肝硬化的預測價值尤為重要。

miRNA由21～25個核苷酸組成，其異常表達與器官纖維化、腫瘤細胞的侵襲、遷移等有關[13,14]。miRNA序列在人類基因序列中的占比僅為3%左右，但參與約35%左右基因水平的調控，在機體生長發育、細胞增殖、分化及凋亡等方面均具有十分重要的作用。近年來，隨著眾學者對miRNA的深入研究發現，在藥物性肝損傷、酒精性肝炎等多種慢性肝臟疾病中均存在miRNA表達水平差異[15-17]。相關研究報道[18-20]，miRNA在肝臟的形態維持、功能發揮方面均起重要作用，其中包括miR-132和miR-125b等。研究發現，microRNA-1273g-3p可能通過調控PTEN參與慢性肝臟疾病的發生、發展。通過對57例CHC患者外周血microRNA-1273g-3p水平進行檢測分析，發現CHC合并肝纖維化患者血清microRNA-1273g-3p水平明顯高于未發生肝纖維患者，且其水平隨著肝纖維化的進展而逐漸升高，可對臨床肝纖維化程度進行判斷。本研究中，有42例CHC患者發生肝硬化，發生率為33.6%。肝硬化組血清microRNA-1273g-3p水平明顯高于CHC組，提示CHC合并肝硬化患者血清microRNA-1273g-3p表達水平上調，呈高表達，發揮促使肝硬化發生的作用，可能參與了肝硬化的發生和發展。

本研究通過分析影響CHC患者肝硬化發生的因素，發現BMI>24.0kg/m2、病程長、輸血制品感染病毒、血脂異常、未抗病毒治療、血清microRNA-1273g-3p高水平等均與肝硬化的發生有關，提示上述指標均是影響CHC患者發生肝硬化的獨立危險因素，需加強防控，逐一控制各項危險因素的不良影響，以達到降低肝硬化發生的目的。相關研究報道，肥胖、血脂異常等均為影響CHC患者肝硬化進程的危險因素。抗病毒治療能夠緩解肝臟炎性反應，可有效延緩肝硬化的發生。本研究結果與上述研究結果相符，近一步證實CHC患者肝硬化發生與BMI、血脂異常、是否接受抗病毒治療等多種因素有關。本研究通過ROC曲線分析顯示血清microRNA-1273g-3p水平預測CHC患者發生肝硬化的最佳截斷點為1.56，其AUC值為0.844，靈敏度為78.6%，特異度為86.8%，準確度為90.4%，說明microRNA-1273g-3p水平在評估CHC患者發生肝硬化方面具有較高的臨床應用價值，可作為早期檢測指標，對CHC患者進行早期的診斷并積極采取有效的治療措施，以降低CHC患者肝硬化的發生率。