非酒精性脂肪性肝炎患者外周血跨膜蛋白6超家族成員2基因表達與心血管疾病的關系*

吳麗蒙，龔 翔，張 燕

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變和肝小葉炎癥為特征的臨床病理綜合征。心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是NASH患者的主要死亡原因。NASH患者發生CVD越嚴重，死亡的幾率越大[1]，表明CVD嚴重影響NASH病情進展和預后。對NASH患者外周血跨膜蛋白6超家族成員2(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)基因水平研究發現其基因變異可降低血脂水平或對心血管疾病的發生起保護作用，提示TM6SF2基因表達狀態或與NASH患者出現CVD有關[2]。TM6SF2為跨膜蛋白，其亞細胞結構主要位于內質網和高爾基體，能夠調節膽固醇代謝，與早期動脈粥樣硬化的形成有關[3]，但目前尚不知其與NASH患者出現CVD的內在聯系。本研究通過分析NASH患者外周血TM6SF2基因rs58542936位點多態性和CVD發生情況，探討了其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年9月～2020年9月我院診治的NASH患者93例，男51例，女42例；年齡為42～61歲，平均年齡為(55.8±7.6)歲。符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[4]的診斷標準，BMI為(25.1±3.0)kg/m2。排除酒精性肝病、病毒性肝炎、自身免疫性肝病和藥物性肝損傷患者。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 外周血TM6SF2基因rs58542936位點多態性檢測 取血液200 μl，加入緩沖液200 μl和蛋白酶K 20 μl，震蕩混勻，放置片刻，加入緩沖液BD 350 μl，充分混勻，離心，將混合液放入含有吸附柱的收集管中回收液體，然后依次加入緩沖液GDB 500 μl、漂洗液PWB 600 μl。每加入一種液體，均在12000 r/m下離心30 s，去除液體，而后于吸附膜中間位置滴加洗脫緩沖液TB 100 μl，室溫下放置2 min，在12000 r/m下離心2 min，獲得檢測樣本，使用紫外分光光度儀檢測DNA純度，加入ddH2O將DNA稀釋到20 μg/μl。應用TaqMan探針法行TM6SF2基因rs58542936位點分型，引物序列為rs58542936-F：TGTCTCAGAACAAACAAACAAACAGA；rs58542936-R：GTAGGGGG

TGGTGAGGAAGAAC。采用PCR法擴增，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火/延伸1 min，共40個循環。然后，將得到的樣品分裝至384孔板中，通過聚類分型和擴增曲線進行基因序列檢測，依據終點熒光的讀取，自動行等位基因分型。對單獨出現一種熒光信號者，判定為純合性；同時出現兩種標記的熒光信號者為雜合型。

1.3 心功能指標檢測 使用Philip IE33型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為2.0～5.0 MHz，測量左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和頸動脈內中膜厚度(intraarterial media thickness，IMT)。根據《實用臨床心腦血管病學》診斷CVD。

2 結果

2.1 TM6SF2基因rs58542936位點基因型和等位基因分布 本組經超聲檢查，診斷合并CVD 35例；經檢測，兩組TM6SF2基因rs58542936位點等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡法則，基因型分布存在顯著性差異(P<0.05)，而等位基因T和C分布差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組TM6SF2基因rs58542936位點基因型和等位基因頻率分布(%)

2.2 NASH患者發生CVD的單因素分析 CVD組在BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、吸煙、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位點為雜合型占比顯著高于NASH組(P<0.05，表2)。

表2 兩組有關指標(%)比較

2.3 影響NASH患者發生CVD的多因素分析 經多元Logistics回歸分析，發現BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位點為雜合型是影響CVD發生的危險因素(P<0.05，表3)。

表3 NASH患者發生CVD的多因素分析

2.4 TM6SF2基因rs58542936位點純合型與雜合型患者血脂和心功能指標比較 雜合型人群血清TC和TG水平顯著高于純合型，LVEF和IMT也顯著大于純合型(P<0.05，表4)。

表4 TM6SF2基因rs58542936位點純合型與雜合型血脂和心功能指標比較

2.5 TM6SF2基因rs58542936位點多態性對NASH患者發生CVD的預測價值分析 TM6SF2基因rs58542936位點多態性預測NASH患者發生CVD的AUC為0.66395，95%CI為(0.590～0.731，P<0.05)。

3 討論

相關報道指出，TM6SF2基因參與肝細胞分泌極低密度脂蛋白的途徑，并能影響調節脂質合成[6-10]。TM6SF2位于19號染色體上，其表達具有一定的組織特異性，主要分布于腎臟、腦組織、小腸和肝臟中，可通過調節甘油三酯分泌、增加細胞內濃度，影響肝臟脂質代謝[11,12]，而心腦血管疾病的發生與機體血脂代謝異常存在密切聯系，提示TM6SF2基因多態性或與心腦血管疾病的發生有關。本研究通過對CVD患者進行分析，結果發現BMI≥28kg/m2、TC≥5.17mmol/L、有心血管疾病家族史及TM6SF2基因rs58542936位點為雜合型是影響CVD發生的危險因素，表明CVD的發生與TM6SF2基因rs58542936位點多態性等有關，這主要與血脂代謝異常可增加亞臨床動脈粥樣硬化及冠脈疾病的風險有關[13,14]。

NASH的發生與內皮功能障礙、氧化應激和胰島素抵抗有關，NASH內皮功能異常不僅會導致疾病進展，還會誘發CVD[15,16]。NASH脂質代謝異常可導致血管內皮細胞損傷及功能改變，使內皮細胞脫落壞死，并可增強單核細胞和T細胞的粘附，促進其向內皮下移行，還可誘導細胞表達多種粘附分子，促進動脈粥樣硬化的發生，進而可能會誘發CVD。而rs58542936位點多態性與NASH患者機體脂代謝異常有關，提示其可能與CVD的發病過程有關。本研究結果發現，TM6SF2基因rs58542936位點多態性會增加NASH患者CVD的風險，提示或可通過檢測該位點基因多態性來預測其是否會出現CVD。本研究中發現，TM6SF2基因rs58542936位點多態性對NASH患者出現CVD具有診斷價值。其原因在于，TM6SF2參與了PPAR的信號通路環節。而PPAR參與了全身和肝臟的脂質代謝過程，可調節肝臟從外周組織攝取脂肪酸的能力及脂蛋白載運能力，其表達異常時會導致脂肪在肝臟堆積，并能影響全身脂質代謝[17,18]，故而會增加心腦血管發生的危險性，故可通過檢測TM6SF2基因多態性來預測患者患CVD的概率。

內臟脂肪組織被認為是心血管事件和代謝狀況風險增加的重要指標，而心外膜脂肪組織與內臟脂肪組織有相同的胚胎起源，是沉積在心肌和心包之間的內臟脂肪組織，可表達多種細胞因子和蛋白，影響血管內皮功能。本研究發現，TM6SF2基因rs58542936位點雜合型TC、TG水平高于純合型，LVEF、IMT值大于純合型，表明TM6SF2基因rs58542936位點雜合型患者的心功能較差，這主要是因為該位點基因多態性可能會抑制內臟脂肪組織代謝，導致大量膽固醇在內臟蓄積，并能誘導血管平滑肌細胞血小板源性生長因子的表達，促進血管平滑肌增生，影響血管舒張、收縮及血液凝固過程，間接促進動脈粥樣硬化形成，而影響患者心臟功能。