膽囊癌患者膽囊癌組織泛素結合酶E2T蛋白表達及其臨床意義探討*

于 濤，李奎武，姚 琳，呂 武

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率約為2.5/10萬。該病預后極差，5 a生存率僅為5%[1]。雖然外科根治性手術可提高患者長期生存率，但由于該病發(fā)病較為隱匿，惡性程度較高，診斷時符合手術條件的患者占比較低，而失去手術機會的晚期GBC患者僅能接受放化療和靶向藥物等姑息性治療[2，3]。近年來，免疫治療在GBC患者的臨床治療方面受到廣泛的關注。研究發(fā)現(xiàn)抑癌因子與腫瘤蛋白表達失衡對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的影響。泛素化是指包括泛素分子、泛素活化酶、泛素結合酶等多種分子在內(nèi)的蛋白質修飾過程，對于維持腫瘤細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[4，5]。泛素酶E2T(ubiquitinase E2T，UBE2T)是泛素-蛋白酶系統(tǒng)的關鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究發(fā)現(xiàn)了UBE2T在結直腸癌、鼻咽癌和肝細胞癌表達顯著上調(diào)[6-8]，且在不同臨床和病理性參數(shù)人群其表達顯著不同，但其在膽囊癌組織的表達及其臨床意義尚不明確。本研究檢測了GBC患者膽囊癌組織UBE2T的表達情況，旨在為GBC的免疫發(fā)病機制和分子標記物研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2017年12月我院肝膽外科收治的膽囊癌患者50例，男26例，女24例；年齡為30～75歲，平均年齡為(60.0±6.8)歲。符合《CSCO膽道系統(tǒng)腫瘤診斷治療專家共識(2019年版)》的相關標準[9]，均經(jīng)術后組織病理學檢查診斷，入院前未進行過放化療治療。排除標準：①合并嚴重的肝、腎功能不全；②在治療過程中轉院或放棄治療；③圍術期或術后1個月內(nèi)死亡。分別選擇距離癌邊緣>5 cm的癌旁組織和本院收集的正常膽囊組織50例作為對照。納入對象簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 資料收集 通過電子病歷搜索和收集膽囊癌患者的一般資料，包括性別、年齡、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理學分級。

1.3 膽囊組織UBE2T蛋白表達檢測 采用Western blot法，自液氮中取出膽囊組織和癌組織，使用經(jīng)過預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和RIPA細胞裂解液，輕輕吹勻，置于4℃旋轉搖床上充分裂解，提取蛋白。采用BCA法對蛋白質樣品進行定量，調(diào)整蛋白濃度后加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴鍋煮沸5 min，加入蛋白樣品80μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，經(jīng)過脫脂奶粉室溫封閉后，加入羊抗人UBE2T抗體(Abnova生物科技公司)，在37℃溫箱中孵育1～2 h，以PBST洗滌3次，加入二抗，采用ECL法顯色，在暗室中觀察。應用ImagePro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達量。每組實驗3次，取平均值。

1.4 隨訪 采用門診復查或電話隨訪，患者自手術結束開始接受隨訪，間隔3個月1次，隨訪終點為患者全因死亡，或截止至2020年3月1日。

2 結果

2.1 膽囊癌組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T蛋白表達情況 膽囊癌組織UBE2T蛋白表達量為2.9±0.4，顯著高于癌旁組織的(1.5±0.3)或正常膽囊組織的(1.7±0.3，P<0.05，圖1)。

圖1 不同組織UBE2T蛋白相對表達量比較

2.2 不同臨床和病理學特征的膽囊癌患者癌組織UBE2T蛋白表達水平比較 不同性別、年齡UBE2T表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，資料未列出)，而不同TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理學分級組織UBE2T表達差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 不同特征的膽囊癌組織UBE2T蛋白表達比較

2.3 影響膽囊癌患者死亡的危險因素分析 截止到隨訪終點，中位隨訪21.0個月，Logrank分析結果顯示，31例UBE2T高表達(>3.5)和19例低表達(<3.5)膽囊癌患者中位生存時間分別為12.0個月和25.0個月(P<0.05，圖2)；多元Logistic回歸分析結果顯示，TNM分期高、UBE2T高表達、腫瘤浸潤程度高、淋巴結轉移程度高、遠處轉移和病理學分級高是膽囊癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

表2 多元Logistic回歸分析膽囊癌患者死亡的危險因素

3 討論

膽囊癌是一種總體發(fā)病率較低但生存情況較差的惡性疾病[10,11]。流行病學調(diào)查顯示，國外女性與男性膽囊癌發(fā)病比例為2∶1～6∶1，而我國約為1.62∶1。在發(fā)病年齡方面，我國膽囊癌主要集中于60～69年齡段。目前，膽囊癌的臨床診斷和治療存在的主要問題在于膽囊癌診斷較晚，處于I/II期人數(shù)占比較低，診斷時已處于IV期患者占比超過50%，說明對該病的早期臨床診斷手段較為有限[12]。此外，可用于膽囊癌的免疫治療或靶向治療等精準治療方法較少，僅有較少數(shù)的患者接受放療和化療治療，導致患者預后相對較差[13]。因此，迫切需要對膽囊癌發(fā)生和發(fā)展的機制進行研究，尋找可靠的生物標志物用于患者的早期診斷、靶向治療和預后判斷，對于延長患者生命，提高生存率具有重要的意義。

泛素-蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-protease system，UPS)和泛素樣蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-like protease system，UBL)是機體表觀遺傳修飾的關鍵機制，廣泛參與了胚胎發(fā)育和DNA修復損傷等生理過程[14，15]。蛋白質泛素化是一種被嚴格調(diào)控的可逆性生理過程，主要通過泛素化和去泛素化分子發(fā)揮生物學功能，而泛素化和去泛素化分子修飾功能的動態(tài)平衡既是維持底物蛋白半衰期穩(wěn)定的前提，還可維持細胞穩(wěn)定，對于腫瘤的免疫學過程產(chǎn)生直接的影響。泛素是真核生物特有的小蛋白質，由76個氨基酸殘基組成，在進化上高度保守，幾乎參與了真核細胞所有的信號通路及生物學過程[16，17]。目前，發(fā)現(xiàn)的泛素化主要受到泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3組成的泛素化反應體系的調(diào)控，其中泛素結合酶E2可催化泛素轉移過程，并進一步受泛素連接酶的下游調(diào)控[18，19]。其中UBE2T最早因在范可尼貧血DNA修復損傷過程中的作用被發(fā)現(xiàn)，主要定位于染色體1q32.1上，在多種惡性腫瘤中存在明顯的擴增現(xiàn)象。UBE2T可通過將FANCD2和FANCA等因子泛素化的方式，促進DNA損傷的修復，以維持基因組的完整性[20]。體外實驗證明，下調(diào)UBE2T蛋白可增強腫瘤細胞對于DNA交聯(lián)藥物的敏感性[21]。在結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤癌組織，UBE2T表達明顯升高[22，23]。本研究采用Western blot法檢測了膽囊癌患者膽囊組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T相對表達水平，結果顯示，膽囊癌患者膽囊組織UBE2T明顯高于癌旁組織或正常膽囊組織，而正常膽囊組織與癌旁組織UBE2T表達無明顯差異。因此，推測UBE2T可能影響了膽囊癌的發(fā)生過程。

已有學者報道了UBE2T與多種惡性腫瘤患者預后之間的關系。隨著多發(fā)性骨髓瘤患者惡性程度增加UBE2T表達水平也升高，且與患者預后有關[24]。UBE2T高表達與乳腺癌和肺癌患者不良預后顯著相關[25]。本研究結果表明，膽囊癌組織UBE2T蛋白表達與性別或年齡無關，不同TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移喝病理學分級癌組織該蛋白表達不同，提示UBE2T可能參與了膽囊癌的病情發(fā)展及轉移過程[26]。因此，UBE2T作為判斷膽囊癌病情及預后的分子標記物存在一定的潛力。本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析了不同UBE2T表達水平膽囊癌患者的預后情況，結果發(fā)現(xiàn)UBE2T高表達患者預后顯著差于低表達的患者，提示UBE2T可作為膽囊癌患者的預后標記，以指導臨床治療方案的決策。UBE2T在膽囊癌發(fā)生的分子機制尚不明確，但在其他惡性腫瘤，已有研究確定了UBE2T影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的可能機制。在膀胱癌，沉默UBE2T可導致細胞周期在G2/M期阻滯，誘導細胞凋亡[27]。在骨肉瘤，UBE2T高表達可通過激活P13K/Akt信號通路，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[28]。在非小細胞肺癌[29]，體外敲低UBE2T可通過抑制wnt/β-catenin通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

隨著科學研究的不斷推進，蛋白質泛素化作用在惡性腫瘤發(fā)生過程中參與蛋白質降解并通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)各類免疫細胞功能而影響先天免疫和適應性免疫過程，其機制被不斷揭示，蛋白質泛素化分子作為腫瘤治療靶點的價值也不斷顯現(xiàn)。本研究結果證明了膽囊癌患者膽囊組織UBE2T蛋白表達顯著升高，可能與病情及不良預后相關。