腸道菌群促進肝癌發生的機制及其臨床應用

付豪爽 趙爽 謝青

肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全球腫瘤死亡的第三大原因，大多發生于慢性肝病患者中，可以由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD[1])和酒精性脂肪肝引起。微生物群可以調節代謝、炎癥和免疫，在維持健康和疾病發生、發展中發揮重要作用?，F有證據顯示，微生物群在腫瘤發生與抗腫瘤免疫反應中發揮關鍵作用。本文就腸道菌群在小鼠模型和HCC患者中促進HCC發生和發展的機制的研究進展進行綜述，包括生態失調、腸道屏障的破壞和細菌代謝物的作用。此外，本文還回顧了近年來腸道菌群作為HCC患者潛在診斷工具以及免疫治療新靶點的最新進展。

一、腸道菌群與肝癌

微生物存在于人體表面及腸道中，而有效屏障的存在可以阻止微生物入侵人體。這些機制允許人類在代謝、免疫和避免感染等許多方面受益于微生物群。盡管肝臟與微生物群并無直接接觸，但它與腸道有著緊密的解剖聯系。雖然有腸道屏障的存在，但營養豐富的血液從腸道到肝臟的循環還伴隨著腸道菌群衍生的代謝產物的低度暴露，稱其為微生物相關分子模式(microbiota-associated molecular patterns，MAMPs)。

慢性肝病(Chronic liver disease，CLD)與腸道菌群的紊亂有關，稱之為生態失調[1]。此外，腸道屏障的改變導致菌群易位，使CLD患者的肝臟暴露于MAMPs和細菌代謝物。有證據表明，腸道菌群在CLD進展和HCC發生發展中具有重要作用[1-2]。與此同時，微生物群在調節抗腫瘤免疫反應中發揮關鍵作用[1-2]。因此,微生物群具有雙重作用，既促進CLD條件下的腫瘤進展，又具有抗腫瘤的積極作用。

二、腸道屏障破壞和生態失調在CLD進展和HCC發生發展中的作用

大多數肝細胞癌發生在肝硬化患者中。在CLD的早期就已觀察到菌群易位和生態失調，這促進了炎癥、纖維化形成和肝硬化的進展[1,2]。因此，腸道屏障破壞和生態失調是CLD各階段的顯著特征，并促進其逐步發展為HCC(圖1)。

(一)腸道屏障破壞 導致腸道屏障破壞的機制是多方面的。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，通過Toll樣受體4(TLR4)引發炎癥，是MAMPs易位最常用的標記物，門脈LPS水平在CLD發展過程中逐漸升高,在Child-Pugh C級肝硬化患者中達最高；同樣，細菌DNA水平作為TLR9的激動劑，也在CLD發展過程中逐漸升高[3]。這些發現表明，慢性損傷的肝臟容易暴露于大量TLR配體以及其他細菌代謝物中。

(二)生態失調 現有研究表明，肝硬化[4-6]和HCC患者[5-7]均存在生態失調。最近一項研究發現了生態失調在CLD中的重要作用，通過16S測序研究過去十年中幾個主要與生態失調相關的疾病的腸道菌群，包括肝硬化、結腸直腸癌、肥胖和2型糖尿病[4]。該研究表明，腸道菌群變化最能準確預測的疾病便是肝硬化[4]。此外，雖然健康人和肝硬化患者之間的腸道菌群差異最明顯[4,8]，但有證據表明，肝硬化和HCC患者之間亦存在差異[5-7]。一項研究檢測了慢性HBV感染導致的肝硬化和HCC患者的微生物多樣性[6]，發現從健康人到肝硬化，糞便菌群多樣性降低；但從肝硬化到早期HCC合并肝硬化，糞便菌群多樣性增加，同時鑒定出30種微生物標志物并發現放線菌增加，疣狀桿菌減少[6]。而在另一項非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)肝硬化患者的研究發現，與NASH無HCC的肝硬化相比，HCC患者多形桿狀菌和疣微菌科明顯增加，這些腸道微生物分布與鈣保護素濃度和全身炎癥相關。比較HBV相關HCC和非HBV非HCV(non-HBV non-HCV，NBNC)相關HCC患者的腸道微生物群研究中發現，HBV相關HCC患者糞便微生物區系豐度遠高于健康對照組和非HBV非HCV相關HCC患者，NBNC相關HCC患者的糞便含有更多潛在的促炎細菌(大腸桿菌、腸球菌)和低水平的糞桿菌、瘤胃球菌和瘤胃梭菌，導致抗炎短鏈脂肪酸水平下降?？傊?，HCC微生物譜的變化在不同研究中并不一致，可能是由于病因、地區及營養攝入不同所致。但肝硬化患者與HCC患者之間的差異，以及單純肝硬化患者之間的差異少于健康人與肝硬化患者之間的差異。因此,相比HCC診斷，針對肝硬化的以微生物群為基礎的診斷檢測可能會更有效。而微生物群對于HCC發生的影響可能主要與肝硬化改變有關而非特定的HCC相關變化。

三、微生物群在肝臟腫瘤發生中的作用

(一)HCC 迄今為止，所有關于腸道菌群在HCC發生中作用的證據都是基于對小鼠的研究，暫無臨床研究證明特定微生物特征與HCC風險的相關性。在一項小鼠實驗中證明，微生物群及其激活的信號通路促進了HCC的發展。在使用不同方式誘導HCC的模型小鼠中，進行腸道滅菌或者使用無菌小鼠建模，所誘導的HCC信號通路的激活均大大降低；而用微生物衍生的MAMPs或代謝物處理或通過右旋糖苷硫酸鈉破壞腸道屏障，增加全身LPS水平，可促進小鼠肝纖維化和HCC的發生發展[9-12]。

(二)其他肝臟腫瘤 關于腸道菌群在膽管癌中作用的數據目前仍十分有限。在一項研究中，使用16S測序對60名膽管癌患者的腫瘤樣本進行分析。發現在膽管組織中存在以假單胞菌科和草桿菌科為主的具有組織特異性的菌群[13]。同樣，關于腸道菌群在腫瘤轉移中的作用的數據也較少。來自兩個獨立課題組的研究發現在抗生素處理的小鼠中免疫介導的轉移減少[14,15]。

四、相關機制和信號通路

(一)通過MAMPs和TLRs促進炎癥、纖維化和再生，導致腫瘤發生 CLD的腸道屏障破壞導致循環中高水平的MAMPs 如LPS,從而通過多種機制促進CLD進展和HCC發生。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)和DEN +四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)處理的小鼠模型發現，細菌易位可以導致LPS及其受體TLR4表達，繼而誘導HCC形成[9,16]；在7,12-二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)+高脂飲食處理的小鼠中，細菌易位可上調脂磷壁酸及其受體TLR2表達，繼而導致慢性炎癥狀態，促進HCC形成[17]。TLR4介導的HCC發生經由肝常駐細胞介導，除了促進慢性炎癥外，TLR4還可以促進肝纖維化，同時上調肝星狀細胞中上皮調節蛋白的表達，上皮調節蛋白是肝細胞分裂原，可以促進HCC進展[9]。在單純DEN誘導的無肝星狀細胞活化和纖維化的HCC模型中，TLR4不僅促進了炎癥基因的表達，而且還促進腫瘤的增殖，同時又防止其死亡。TLR2在脂肪肝相關的HCC中的作用主要由肝星狀細胞介導，可以導致衰老相關表型(senescence associated phenotype，SASP)，而SASP可能是由次級膽汁酸去氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)以及肝星狀細胞中的Cox2和前列腺素E共同介導[17]，提示這些介質一方面觸發了促腫瘤炎癥，另一方面前列腺素E還可通過對免疫細胞的免疫抑制作用促進HCC的發生。

(二)通過腸道微生物衍生代謝產物促進腫瘤進展 除了MAMPs外，生態失調還改變了腸道菌群的代謝途徑。一項研究證實，高脂飲食的小鼠發生的主要變化是革蘭氏陽性菌的積累，這增強了膽汁酸的轉化能力[10]。次級膽汁酸如DCA可以上調脂磷壁酸及其受體TLR2在肝星狀細胞中的表達，共同導致促腫瘤SASP[17]。腸道菌群依賴的膽汁酸代謝變化促進HCC生長的另一個機制是調節肝臟中CXCL16的表達，及其介導的自然殺傷T (NKT)細胞的募集[14]。用抗生素(抑制細菌轉化次級膽汁酸)或膽固醇(封閉所有膽汁酸)處理小鼠的實驗表明，初級膽汁酸可以上調肝血管內皮細胞CXCL16，繼而導致NKT細胞的募集，NKT細胞又反過來以CD1d依賴的方式殺死腫瘤細胞。另一項研究以高膽固醇-高脂肪的NASH飲食方式作為誘發因素研究NASH導致的HCC，發現抗生素可以抑制HCC的發生，同時伴隨次級膽汁酸的驟降[18]，次級膽汁酸如DCA激活了肝細胞的mTOR通路[18]。此外，短鏈脂肪酸是另一類細菌代謝物，由細菌發酵纖維和抗性淀粉產生。現有研究表明，高含菊粉飲食會促進腸道生態失調小鼠的HCC發生[19]。此外，有研究發現膽固醇可以通過減少膽汁酸從而降低短鏈脂肪酸的促腫瘤作用。腸道菌群產生的可能促進HCC發生的其他代謝物包括三甲胺(trimethylamine，TMA)及其代謝物三甲胺N氧化物(trimethylamine N-oxide，TMAO)和乙醇。TMA由膳食中的膽堿和肉堿經由腸道細菌代謝產生，經腸道吸收后在肝臟轉化為TMAO。高水平的TMAO與胰島素抵抗有關[20]，提示其可能導致NAFLD的進展，同時導致與NASH相關的HCC。此外，乙醇也不斷經由腸道菌群產生并在NASH患者中增加。而乙醇不僅是一種肝毒素，也是一種已知的致癌物。但TMAO在NASH和肝癌發生中的作用，以及腸道菌群產生的內源性乙醇是否促進CLD和HCC的發生目前尚不清楚。

五、微生物群和免疫監視作用

現有研究表明，先天性和適應性免疫應答都可能促進HCC發生或抑制其發展[21](圖2)。部分原因可能是HCC經常發生在慢性炎癥的背景下，盡管免疫細胞是免疫監視的關鍵因子，但也可能通過促進炎癥來誘導CLD中的HCC發生。此外，已有研究在注射DEN的小鼠中證明了B細胞和T細胞的腫瘤抑制作用。與之相反，有研究表明CD8+T細胞可能促進肝臟炎癥從而導致NASH的發生[22]。肝臟免疫監視由不同的細胞群以特定的方式參與。在NASH的背景下，亦發現CD4+T細胞在HCC監測中的重要作用。研究證明，NASH可以導致亞油酸積累，繼而導致活性氧介導的CD4+T細胞死亡，從而導致腫瘤生長加快[14]。無論是來自人類樣本中原位分析B細胞和T細胞相互作用的數據，還是對小鼠的研究，都顯示了B細胞在HCC的免疫監視中的作用，而CD4+調節性T細胞和髓系抑制細胞的積累則已被證明具有損害效應T細胞和NK細胞的作用。

圖2 腸道微生態調控炎癥和免疫監視

雖然有許多研究評估腸道菌群在HCC發生和發展中的作用，但腸道菌群影響肝臟免疫監視的機制尚不清楚。現有研究表明，腸道菌群和免疫系統之間存在著密切聯系,其不僅調節腸內的局部免疫，而且對全身免疫也有調節作用[23]。而這種作用歸因于MAMPs和細菌代謝物，如短鏈脂肪酸和膽汁酸[24]，這些分子通過TLRs、GPR41、GPR43等受體在免疫細胞中發揮免疫調節功能。此外，現有研究表明，腸道菌群控制了小鼠對HBV的免疫反應，從而導致在6周抗生素治療后無法清除HBV[25]。由此可知，腸道菌群改變可能以正向或負向的方式調控具有HCC風險的患者的免疫監視功能。

六、微生物組作為HCC的篩查標志物和治療靶點

(一)應用微生物組進行HCC篩查和診斷 大多數HCC患者確診時已處于晚期。而腸道菌群可能是篩查早期HCC理想的生物標志物。最近一項研究對來自中國的75例HBV和HCV感染的HCC患者進行了研究，以評估微生物群作為HCC非侵入性生物標志物的潛力，其結果在另一項研究得到了驗證[6]。如前所述，從肝硬化到HCC早期，糞便菌群的多樣性增加，同時鑒定出30種微生物標記[6]。因而，腸道菌群作為生物標志物為早期診斷HCC提供了潛在的非侵入性工具。

(二)靶向微生物群預防肝癌 在動物研究中，微生物群在促進CLD和HCC的發生、發展中具有關鍵作用。因此，微生物群有可能成為預防HCC的一個新靶點。其中有多種方法可以考慮，包括抗生素、TLR拮抗劑以及細菌代謝產物抑制劑等[2]。另外對小鼠的研究表明，使用抗生素治療可能會有效減緩進展期HCC的發展[9]。因此，隨著研究的進展，或許可以將靶向腸道菌群作為肝硬化高危人群的一級預防，或作為HCC手術切除患者的二級預防策略。

(三)利用微生物群治療HCC的免疫療法 最近一些研究探討了腸道菌群可能在調節免疫檢查點抑制劑治療反應中的重要作用。免疫檢查點抑制劑針對T細胞表面的免疫調節分子或其配體，增強抗腫瘤免疫反應，并已被批準用于治療HCC患者。然而，在非小細胞肺癌、腎細胞癌或尿路上皮癌患者中，抗生素的使用對免疫檢查點阻斷的應答存在負面影響[26]。與未使用抗生素的患者相比，在抗PD -1/PD-L1單克隆抗體治療前、中、后的近期常規使用抗生素，患者的無進展生存期和總生存率顯著降低。該發現與最近一項小鼠實驗結果一致，將對免疫檢查點阻斷療法有反應的腫瘤患者的糞便菌群移植到無菌小鼠體內，可以改善PD-1阻斷的抗腫瘤效果；而來自無反應患者的糞便菌群則無該作用[26]。

由此可知，調節腸道菌群可能是當前抗腫瘤治療的一個新靶點。鑒于HCC和肝硬化患者通常存在嚴重的腸道生態失調，可能導致某些患者的免疫治療失敗，因而調節腸道菌群對于HCC的作用可能比其他腫瘤更有意義。多個通過調整腸道微生物群治療非HCC的癌癥患者的臨床試驗已經開始，包括萬古霉素聯合免疫檢查點抑制劑的一項臨床試驗正在進行中。但迄今為止，尚不清楚上述關于腸道菌群在小鼠和其他腫瘤類型患者的抗腫瘤免疫反應中的作用的研究結果是否也適用于HCC患者。

七、展望

在過去幾年中，我們見證了腸道菌群在健康和疾病中的作用的知識爆炸。對腸道菌群的進一步了解有助于預防、診斷和治療HCC。治療可能通過促進抗腫瘤免疫直接或間接地發揮作用。當然，治療策略并不限于免疫方法，也包括其他應用，如預防腫瘤惡病質，改善化療引起的副作用或增強其療效。另外，腸道菌群可能因地區、營養和生活方式的不同而具有顯著差異，因此并不是所有的結論都是可概括的。未來的臨床研究需要對樣本采集、細菌裂解等進行標準化，以提高比較不同試驗和臨床中心的結果的能力[27]。綜上所述，目前只是腸道菌群研究時代的開始，肝臟和腸道的緊密聯系將為HCC患者的微生物預防、診斷或治療提供更多思路和方向。