骨橋蛋白在慢性肝病發病機制中的作用

楊依娜 朱婭梅 馬世武

骨橋蛋白(OPN)于1986年首次報道，是小整合素結合配體N端連接糖蛋白家族的成員，其單詞前綴osteo-表示骨骼，后綴-pontin表示橋接，提示OPN在細胞外基質(ECM)中發揮連接蛋白的作用[1]。近年來的很多研究借助OPN基因敲除小鼠(Opn-/-小鼠)和肝細胞過表達OPN的轉基因小鼠(OpnHEP Tg)等模型解釋OPN在慢性肝病中的作用[2]。

一、OPN的表達與功能

OPN由分泌磷蛋白1(SPP1)基因編碼，與小鼠Spp1基因的同源性約為84%，其生理作用與OPN糖基化高度保守的受體結合域、翻譯后修飾(PTM)、裂解、聚合和形成五種亞型(OPN-a、-b、-c、-4和-5)等相關[2]。全長SPP1 mRNA翻譯產生分泌型OPN(s-OPN)，非AUG密碼子下游基因翻譯產生細胞內型OPN(i-OPN)。生理狀態下，SPP1在人和小鼠的胎盤、腎臟、腦和肝臟中大量表達；在正常肝臟組織中，膽管細胞中SPP1表達較高，其次為巨噬細胞(MFs)、肝細胞、竇狀內皮細胞、肝星狀細胞(HSCs)、T淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK)。OPN表達的調節具有組織特異性，不同細胞類型可有不同的調節機制。OPN受體有整合素和CD44家族，OPN以旁分泌或自分泌方式激活CD44和整合素，誘導PI3K/Akt和有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號；OPN表達還與β-catenin、NF-κB、MMP2等信號通路相關。OPN具有多種生物學功能，在生物礦化﹑骨重塑﹑細胞介導的免疫應答和傷口愈合等方面中發揮重要作用。人乳中含OPN約138 mg/L，可促進免疫力和器官發育，而富含牛乳OPN的嬰兒配方食品的免疫調節作用不弱于母乳。

二、OPN與慢性肝病

(一)肝臟脂肪變性 在酒精性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者和動物模型中，血清和肝臟的OPN水平升高[3-5]。飲酒誘導的OPN可以抑制肝細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體α的表達，促進肝脂肪變性；在Opn-/-小鼠中，大量酒精攝入可降低肝甘油三酸酯[3]。相似的，長期攝入酒精的Opn-/-小鼠肝細胞中鐵含量增加，促進ALD進展；但肝細胞過表達OPN卻能緩解ALD[6]。補充牛奶OPN可以保持腸道完整性和維持腸道細菌平衡，從而預防ALD；OPN可結合LPS，降低TNF-α的產生和氧化應激，從而減少脂肪變性性和ALD[5]。說明不同來源的OPN在ALD中發揮不同作用。

細胞外OPN能促進肥胖和調節脂質合成，從而驅動肝脂肪變性性[4]。在非肥胖NAFLD患者中，血清OPN與肝臟甘油三酯和膽固醇呈正相關；在肥胖患者中，血清OPN與肝臟甘油三酯和膽固醇負相關，說明OPN在脂肪組織和肝臟中誘導脂肪變性性的作用不同[4]。脂肪組織中OPN的增加與MFs聚集有關。在肥胖高脂飲食(HFD)模型中，Opn-/-小鼠或經OPN中和都可降低脂肪組織的炎癥和胰島素抵抗，表明細胞外OPN能引起代謝綜合征和脂肪變性性。向野生型(WT)小鼠注射重組OPN可使肝膽固醇含量增加，表明OPN在調節膽汁酸和肝臟脂肪生成中發揮作用。關于OPN在Opn-/-小鼠NAFLD中的作用尚無定論[2]。Opn-/-小鼠喂食HFD后較少發生脂肪變性性；然而，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病Opn-/-小鼠模型在給予HFD后顯示肝臟甘油三酯增加。此外，Opn-/-小鼠喂食蛋氨酸缺乏的飲食或含2%膽固醇的HFD對肝脂肪變性性沒有影響，卻對纖維化有保護作用。

OPN通過抑制自噬和增加肝細胞衰老在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的進展中發揮作用[2]。來自NASH患者和小鼠的數據顯示，OPN在肝細胞浸潤的MFs中表達增加。肝細胞來源的OPN可防止ALD中的肝脂肪變性性[5]。

(二)肝臟炎癥 從肝硬化和HCC患者肝臟的scRNA-Seq分析中發現，SPP1表達在各種炎性細胞亞群中增加[7-8]。在肝臟炎癥中，活化的MFs和Kupffer細胞分泌OPN，其作為旁分泌或自分泌信號通過與α4β1和α9β1整合素結合來刺激MFs遷移。i-OPN通過與CD44-ezrin-radixin-moesin復合物結合來促進MFs遷移，OPN在未成熟樹突狀細胞中的表達較高，并通過與αvβ3整合素和CD44結合而助其成熟和遷移。T細胞活化后，OPN會增加Th1和Th17細胞的分化。NK細胞的穩態和功能受i-OPN調節，NK細胞中i-OPN的低表達會損害其抗腫瘤反應。OPN可誘導嗜中性粒細胞遷移，促進ALD。

(三)肝纖維化 肝損傷后，肝細胞和炎性細胞可分泌OPN，但HSCs能產生OPN卻不能分泌OPN[2]。在乙型和丙型肝炎患者中，血清OPN水平隨纖維化分期增加而逐漸增加；在NAFLD相關肝纖維化中，血清OPN水平也升高[9-10]。血清OPN還被看作酒精性肝硬化和NASH所致肝硬化嚴重程度的生物標志物，且在肝纖維化中起關鍵作用；它通過TGF-β依賴性機制激活HSCs，并誘導I型膠原纖維沉積。研究還發現，重組OPN可激活原發性造血干細胞，增強其浸潤和傷口愈合的可能。從WT小鼠中分離出HSCs比從Opn-/-小鼠中分離出HSCs具有更高的成纖維性，轉染負載OPN腺病毒的HSCs可過度表達OPN，增加I型膠原表達。OPN介導的I型膠原誘導是通過αvβ3整合素參與和PI3K-pAkt-NFκB信號通路的激活，而CD44的結合則不參與[11]。注射四氯化碳(CCl4)或飲用硫代乙酰胺導致的急性和慢性肝損傷會提高OPN的表達。過表達OPN的OpnHEP Tg小鼠會發展為自發性肝纖維化。長期注射CCl4和硫代乙酰胺，WT小鼠可造成肝纖維化，Opn-/-小鼠則較少，OpnHEP Tg小鼠則較多[11]。

高遷移率族box-1(HMGB1)是與肝纖維化相關的損傷分子模式，研究發現OPN是在HMGB1上游發揮作用。進展期的慢性丙型肝炎，肝臟OPN表達和HMGB1免疫染色均增強，并與纖維化分期相關；在非進展期的丙型肝炎，則無明顯變化。注射CCl4的OpnHEP Tg小鼠中，伴隨著HMGB1的誘導可建立良好的肝纖維化模型；在WT小鼠模型中，OPN和HMGB1都較少；而在Opn-/-小鼠中幾乎不存在。與能分泌OPN和HMGB1的肝細胞共培養，或者用重組OPN或HMGB1分別進行刺激，可增強HSCs中I型膠原蛋白表達，重組OPN可誘導HSCs中HMGB1乙酰化，導致I型膠原蛋白上調[12]。

(四)肝細胞癌 在HCC中，SPP1 mRNA和OPN蛋白表達增加。研究表明，肝癌細胞可分泌OPN，HCC患者血清OPN升高[13]。OPN被視作HCC的血清生物標志物。在診斷HCC相關的meta分析中，血清OPN的ROC曲線下面積高于甲胎蛋白。此外，OPN還與肝癌患者預后不良相關。研究表明手術切除后患者血清OPN與低總體生存率和無瘤生存率相關，也與HCC高分期、腫瘤大小、血管侵犯相關。在Opn-/-小鼠中，注射二乙基亞硝胺(DEN)后腫瘤表達減少[13]。喂食膽堿缺乏飲食的Opn-/-小鼠HCC模型，腫瘤表達更少，而喂食HFD的鏈脲佐菌素誘導的Opn-/-小鼠則相反。這些差異可通過OPN的細胞起源或i-OPN與s-OPN的作用解釋。

在肝癌細胞系的研究中，重組OPN可誘導肝癌細胞侵襲；OPN過表達會增加肝癌細胞增殖、莖樣特性、糖酵解、自噬和對化療的抵抗力；在具有干細胞特征和成球能力的HCC細胞中，OPN表達上調；而敲除SPP1會降低HCCLM3和HepG2細胞的增殖、遷移和對化療的敏感性；然而，OPN能抑制甚至阻斷HCCLM3細胞的肺轉移，提示靶向OPN可能是晚期HCC的治療方法[14]。在小鼠和人類肝癌中，OPN和PD-L1之間存在相關性，表明OPN參與免疫逃逸[13]。與正常肝組織相比，OPN-a和OPN-b在癌組織中表達增加，在HCC中具有重要作用。

(五)膽道疾病 生理條件下，OPN在膽管上皮細胞中表達，并在肝損傷后被高度誘導[7]。然而，OPN在膽管疾病的發病機理中的作用尚未清楚。與健康對照組相比，膽道閉鎖(BA)或膽汁淤積性肝病患者在肝臟中均有SPP1表達，原發性膽汁性膽管炎(PBC)患者的膽管浸潤的單核細胞細胞質中觀察到OPN的強表達。此外，BA患者血漿中OPN的增加與總膽紅素有關，表明其作為BA早期診斷標志物的潛力。使用輪狀病毒誘導的BA鼠模型，相較Opn-/-小鼠的生存期較短。大多數表達OPN 細胞產生IgG或IgM抗體，表明OPN可以通過漿細胞擴增觸發膽管損傷[2]。在鼠原發性硬化性膽管炎(PSC)模型中，尚未能觀察到OPN在發病機制或膽道纖維化中的作用，但也不能完全表明OPN在PSC的發生發展中無關。

寡核苷酸微陣列分析顯示，OPN是肝內膽管癌(ICC)患者中表達最多的基因。與鄰近肝組織及正常膽管相比，ICC中OPN表達量更高。ICC患者基質中的OPN表達與腫瘤大小和侵襲行為呈正相關。即使在手術切除后，OPN仍是ICC患者預后不良的獨立預測因素[15]。OPN激活MEK-MAPK1途徑并介導β-連環蛋白的磷酸化，從而激活Wnt信號傳導。存在OPN-443(CC)變異的患者有較高的淋巴和遠處轉移發生率，支持了OPN-443多態性在預測轉移中的價值。

雖然OPN明確參與慢性肝病的發病機制，其表達增加與肝脂肪變性、肝臟炎癥、肝纖維化、HCC等的發生發展相關，但OPN的表達增加卻利于阻斷晚期HCC轉移，其在不同的肝組織病變中的具體作用機制和診斷價值有待進一步探索。研究OPN在細胞內信號轉導途徑，探討OPN是否能作為肝臟疾病的一個治療靶點，具有其重要價值。