骨肉瘤細胞中miR-215-5p和eIF2a靶向關系及臨床意義

張 哲，程漠松，莊 鶴，田曉東

(錦州市第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

骨肉瘤的形成涉及機體多種遺傳因子，包括DNA、RNA等分子遺傳改變。近年研究顯示骨肉瘤的發(fā)病率呈明顯的升高趨勢[1-3]。蛋白質(zhì)合成是維持細胞穩(wěn)態(tài)和腫瘤細胞增殖的關鍵步驟，在蛋白質(zhì)翻譯過程中真核細胞翻譯起始因子常發(fā)生變化，對于調(diào)控下游的腫瘤性增殖起重要作用。真核細胞翻譯起始因子2a(Eukaryotic translation initiation factor 2a,eIF2a)參與其中，其對細胞增殖、腫瘤細胞遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均有重要價值[2]。eIF2a發(fā)揮作用過程中受多種因子的調(diào)控，微小RNA(microRNAs,miRNAs)是eIF2a上游調(diào)控的重要因子[4-7]，本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫初篩和前期實驗的篩選，選擇可能與eIF2a有結(jié)合位點的miR-215-5p進行相關實驗研究。本實驗基于骨肉瘤細胞進行實驗設計，探討miR-215-5p與eIF2a的靶向關系，分析二者表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人骨肉瘤細胞系Saos2購于中國科學院上海細胞生物學研究所。TRIZOL、細胞培養(yǎng)基PRMI1640及胎牛血清購自美國Gibco公司，ECL顯色液購自美國Thermo公司，eIF2a購自蘇州睿瀛生物技術(shù)公司，GAPDH、DAB和二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RIPA裂解液、胰酶消化液、質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自武漢三鷹生物公司。Lipofetamine 2000和雙熒光素酶試劑盒購自美國Invitrogen公司。引物由上海吉瑪生物合成。酶標儀為Thermo公司生產(chǎn)的MK3。PCR儀為美國Bio Rad IQ5。

1.2 研究對象 選擇2018年1月至2020年12月在我院確診為骨肉瘤并行手術(shù)治療的患者38例作為觀察對象。病例納入標準：①均有術(shù)后病理診斷，且符合WHO中的標準；②首次發(fā)病并確診；③臨床隨訪資料完整。排除標準：①伴有其他器官惡性腫瘤；②家族遺傳性疾病；③術(shù)前行放、化療。患者中男20例，女18例，年齡5～78歲，平均(18.1±4.5)歲。留取術(shù)后腫瘤組織新鮮標本(-80 ℃保存)和石蠟包埋標本。研究經(jīng)醫(yī)院倫委員會批準同意，符合《赫爾辛基宣言》中的要求，家屬簽定知情同意書。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細胞系Saos2應用10%胎牛血清、1%青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長至80%時進行傳代，調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml接種于12孔板中，每孔1 ml。構(gòu)建質(zhì)粒進行細胞轉(zhuǎn)染，建立陰性對照組、無關序列組、miR-21-5p mimic組、miR-21-5p inhibitor組。操作嚴格按說明書操作，減少污染及人為誤差。

1.3.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簯秒p熒光素酶報告基因?qū)嶒炗^察miR-215-5p與eIF2a 3’UTR的結(jié)合情況。將含有eIF2a mRNA 3’UTR的野生型(pGL3-eIF2a-WT)和突變型(pGL3-eIF2a-MT)報告質(zhì)粒，分別同miR-215-5p mimic、陰性對照組(NC)共轉(zhuǎn)染到細胞系Saos2中，4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察熒光素酶的活性。

1.3.3 miR-215-5p的檢測：應用實時熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)檢測miR-215-5p的表達。TRIZOL提取總RNA并進行驗證。miR-215-5p引物上游：5’-TCGTGTCGTAGTGTGACTGTGG-3’，下游：5’-GCCTGTATAGGACACGTACT-3’。U6為內(nèi)參，引物上游：5’-GGCAGACGCGAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAACGCAAATTCCG-3’。應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個循環(huán)后進行延伸。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結(jié)果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對照(校正樣品)]。

1.3.4 Western blot實驗：應用Western blot法檢測eIF2a的表達。以GAPDH作為內(nèi)參。依次行蛋白提取、濃度測定、變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及免疫雜交進行實驗后，取出膜加入發(fā)光液 3 min，顯影20 s。以目的蛋白與GAPDH的比值作為結(jié)果進行半定量分析，應用Image J分析完成。嚴格按實驗步驟操作，做好質(zhì)控工作。

1.3.5 免疫組化實驗：組織常規(guī)行取材、脫水、石蠟包埋后，切取4 μm切片，應用免疫組化Envision 法檢測eIF2a的表達，DAB顯色，嚴格按實驗步驟操作，設陽性對照，做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。結(jié)果由病理醫(yī)師進行判讀，應用盲法，eIF2a的顯色部位是細胞質(zhì)，以黃色-棕褐色為陽性。應用著色強度及陽性率的綜合評分法。著色強度：無著色為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。陽性率：選擇熱點區(qū)進行觀察，共選擇5個400倍視野，以陽性率<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～25%為2分，以26%～50%為3分，以>50%為4分。兩者相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤5分為陰性，以>5分為陽性。計算陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果 Target Scan數(shù)據(jù)庫顯示miR-215-5p與eIF2a具有可能結(jié)合的堿基序列。見圖1。

圖1 Target Scan數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

2.2 eIF2a在不同組別細胞系中的表達 miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達明顯低于陰性對照組和無關序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達明顯高于陰性對照組和無關序列組。見圖2。

圖2 eIF2a在不同組別細胞系中的表達

2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關系。見圖3。

注:miR-215-5p mimic與eIF2a+WT比較，*P<0.05

2.4 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達量、eIF2a陽性情況比較 骨肉瘤中miR-215-5p表達范圍是1.2～3.4，平均2.3±0.3。eIF2a共20例陽性，陽性率為52.63%。由表1可見，miR-215-5p的表達量、eIF2a的陽性率在骨肉瘤不同腫瘤最大徑和病變級別中的比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡及周圍組織累犯中的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1(圖4)。

表1 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達量、eIF2a陽性情況比較

A：miR-215-5p表達的擴增曲線(PCR)；B：eIF2a在骨肉瘤中陽性表達(免疫組化,×200倍)

2.5 骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a表達的相關性分析 應用Spearman相關分析顯示骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a呈負相關性(r=-0.67,P=0.0146)。

3 討 論

骨肉瘤的發(fā)生與機體的遺傳物質(zhì)改變有關，其中包括DNA、RNA和相關蛋白質(zhì)的異常表達[8-10]。miRNAs是近年學者關注到的非編碼RNA，其主要是通過調(diào)控下游因子發(fā)揮生物學作用，其異常表達與腫瘤的進展相關[11-13]。本研究基于骨肉瘤細胞系及骨肉瘤術(shù)后的病變組織進行實驗研究，結(jié)果顯示miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達明顯低于陰性對照組和無關序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達明顯高于陰性對照組和無關序列組，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關系，且經(jīng)骨肉瘤組織中的相關分析得以進一步明確，提示miR-215-5p與eIF2a具有明確的靶向關系，miR-215-5p可能作為上游因子調(diào)控下游因子eIF2a的表達，參與eIF2a調(diào)控的細胞增殖、凋亡、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。研究顯示骨肉瘤中miR-215-5p的表達量、eIF2a的陽性率在不同腫瘤最大徑和臨床分期中差異有統(tǒng)計學意義，由于上述兩個指標均為腫瘤進展的重要指標，提示miR-215-5p低表達、eIF2a高表達參與腫瘤的進展過程。miR-215-5p對腫瘤的調(diào)控具有直接作用。有研究顯示miR-215-5p低表達時對腫瘤細胞增殖因子和凋亡相關因子有調(diào)節(jié)作用，認為miR-215-5p具有抑癌基因樣的生物學作用[14-17]。miR-215-5p對細胞增殖的調(diào)控與對細胞周期的作用有關[18]。miR-215-5p可能對調(diào)控G0/G1期有一定作用。有研究顯認為miR-215-5p異常表達使腫瘤細胞增殖的周期縮短，有效提高腫瘤細胞增殖的速度，其可能是通過靶因子EGFR發(fā)揮調(diào)控作用的[19]。抑制凋亡是miR-215-5p低表達時的經(jīng)典作用，使細胞自身的程序性死亡細胞減少，腫瘤細胞具有“永生化”的特點。骨肉瘤病變的分級與預后直接相關，而病理學形態(tài)診斷中病變的分級常缺少客觀指標，即往認為Ki67等增殖指標可能有助于分級，但是其臨界值學者很難達成共識。本研究發(fā)現(xiàn)的miR-215-5p的表達與骨肉瘤病變的級別相關，提示miR-215-5p可能為臨床病理診斷中判斷病變分級提供客觀的參考指標。EIF2a作為miR-215-5p調(diào)控的下游因子，可以引起Cyclin D1的增殖，并通過ATF4等途徑調(diào)節(jié)MMPs的表達，從而增加了腫瘤細胞的侵襲能力。也有研究認為PERK是eIF2a的上游信號分子，共同調(diào)節(jié)VEGF發(fā)揮腫瘤的促血管生成的作用，進而促進腫瘤的進展[20]。但是關于miR-215-5p/eIF2a調(diào)控的具體通路及作用機制有待更多實驗證實。

總之，骨肉瘤細胞中miR-215-5p和eIF2a具有靶向關系，miR-215-5p與eIF2a的異常表達可能參與腫瘤的進展。