重組甜味蛋白Monellin在E. coli中的表達條件及其對ICR小鼠血糖的影響

楊冬梅，王晨璐，劉嘉健，方越，葛瑛，韓淳致，曹榮月*

(1.中國藥科大學 生命科學與技術學院，南京 211198；2.澳門大學 國際中華醫藥研究院，澳門 00853)

糖尿病是一種嚴重的慢性病，過去幾十年中，隨著人們生活水平的不斷提升，糖尿病的病例數和患病率都在穩步上升[1]。目前，糖尿病無法根治，患者的飲食控制對治療效果起著至關重要的作用。糖尿病患者需要避免攝入高糖、高脂、高蛋白的食物，尤其是糖類食品對高血糖、肥胖癥患者有著強烈的升血糖作用，影響患者的治療效果[2]。糖類物質是引起甜味感覺的主要物質[3]，隨著糖尿病患者的增加和低糖飲食人群數量的上升，為了滿足消費者對甜味物質的需求，研究人員把目光轉向非糖類甜味劑?，F今市場上的非糖類甜味劑主要有3類[4]，分別為人工合成非營養型甜味劑、糖醇類甜味劑、營養性非糖甜味劑[5-6]。目前人工合成的非營養型甜味劑作為常用食品添加劑被廣泛地應用在各類食品中，雖然人工合成甜味劑對人沒有直接的危害,但其安全性問題尚無定論，而且過量使用可能會影響人體的代謝，對機體功能造成危害[7-9]。甜味蛋白作為一種新型營養性非糖甜味劑，近些年的研究日漸廣泛。不同于攝入蔗糖等被分解為葡萄糖，甜味蛋白攝入后被分解為氨基酸，沒有直接且快速的升血糖作用，因此對于高血糖、易肥胖者具有重要的應用意義。目前已有8種天然甜味蛋白被發現和研究，其中Monellin最初是從西非森林植物DioscoreophyllumcumminsiiDiels紅色漿果中分離提純得到的一種甜味蛋白[10]，天然Monellin由45個氨基酸殘基和50個氨基酸殘基的兩條多肽鏈通過非共價鍵連接在一起組成[11]。目前Monellin已經被美國食品和藥物管理局 (FDA)批準為“公認安全”的食品添加劑?，F有研究表明，按照不同的評估標準，Monellin的相對甜度是蔗糖的800～2000倍不等，可用作甜味劑和增味劑[12]。與人造甜味劑相比，Monellin擁有一些重要的優勢，它可以用作非碳水化合物甜味劑，開發成為糖尿病患者的安慰性甜味劑或甜酵母片[13]，其安全性高并且不會將非天然代謝物引入人體，也不會干擾氨基酸庫的平衡，另外，Monellin蛋白基因相對容易克隆，可以引入到食品和飲料工業中使用的許多微生物中,具有巨大的市場潛在應用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種及質粒

實驗室保存的E.coliBL21(DE3)菌種，pET28Monellin質粒：蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 實驗動物

ICR清潔級雄鼠：揚州大學比較醫學中心，生產許可證:SCXK(蘇)2017-0007。

1.1.3 實驗試劑

SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit、蛋白非預染MarkerⅡ、IPTG：生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常見市售分析純試劑。

1.1.4 儀器設備

HL-2恒流泵 上海滬西分析儀器有限公司；2000/2000c NanoDrop分光光度計 Thermo Fisher Scientific公司；Beidi-1000E超聲波細胞破碎儀 南京貝帝實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1E.coliBL21(DE3)電轉感受態的制備

在超凈工作臺中，將E.coliBL21(DE3)菌種的單克隆挑至滅過菌的LB試管中，活化8 h。按照1∶100的比例接種至20 mL LB培養基中，過夜活化。按照1∶100的比例接種至500 mL LB培養基中，當OD600值達到0.5時，迅速將菌液冰浴，并搖晃菌液使其快速冷卻。待菌液冷卻后，將菌液分裝至預冷的離心杯中離心20 min。倒掉上清液后，用 250 mL預冷的10%甘油溶液輕輕重懸，離心20 min。棄上清液，用10 mL 預冷的10%甘油溶液輕輕重懸，離心。于沉淀中加入1 mL預冷的GYT溶液輕輕重懸，混勻，測定波長在600 nm處的OD值。用GYT溶液將剩余的細胞重懸至細胞濃度在2×1010～3×1010個細胞/mL。用1.5 mL EP管分裝，于-80 ℃保存。

1.2.2 重組子的轉化

將2 μL公司合成的重組產物加入制備的電轉感受態細胞中，輕輕混勻，然后將其全部吸入預冷的0.2 cm電轉杯中，插入電轉儀。電擊完成后，加入1 mL SOB培養基混勻，全部轉入新的1.5 mL EP管中，在37 ℃搖床中孵育 2 h。離心孵育后的菌液，吸去900 μL上清液，用200 μL微量移液器輕輕吹懸底部菌體，吸出20 μL擴培到試管，其余的菌液均勻涂布到含有KNA抗性的平板上，倒置過夜培養。

1.2.3 陽性克隆菌株的獲得

將陽性單菌落用牙簽挑下至已滅菌的含有3 mL LB培養基的10 mL試管中，培養12 h后收集菌體，提取質粒進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察核酸條帶位置，判斷轉化是否成功。

1.2.4 生長曲線

取活化后的菌種BL21(DE3)-pET28a Monellin按1∶100的比例接種于加有KNA的LB培養基錐形瓶中，于搖床培養24 h，以未接種菌體的培養基為空白對照，每隔一段時間測定培養基的OD600值，以光密度(OD600值)為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。根據生長曲線確定加入誘導劑的時間。

1.2.5 乳糖誘導和IPTG誘導的濃度梯度與時間梯度對比實驗

進行濃度梯度、時間梯度的乳糖誘導與IPTG誘導的探索實驗，通過SDS-PAGE電泳的條帶，比較不同誘導條件下目的蛋白的表達效果，從而得出誘導的最佳條件。

1.2.5.1 菌種接種

取活化后的菌BL21(DE3)-pET28a Monellin(1∶100)接種于加KNA的LB培養基試管中，于搖床培養至OD600值約為0.6時加入誘導劑。

1.2.5.2 乳糖和IPTG最適誘導時間

取經過搖床培養至OD600值為0.6的試管3支，3支均取樣記為0時樣品，其中一支試管不加入任何物質，作為空白對照；一支試管中加入IPTG使其終濃度為0.9 mmol/L；向第三支試管中加入乳糖使其終濃度為8 g/L，繼續搖床培養，每間隔1 h取一次樣，空白組取培養終點樣，乳糖和IPTG每支試管均取8個時間點的樣。

1.2.5.3 乳糖和IPTG最適誘導濃度

取14支經搖床培養至OD600值為0.6的試管，分為兩組，每組7支。向第一組各管中加入乳糖溶液使其終濃度分別為0，4，6，8，9，10，11 g/L，培養4 h后收集菌液。向另一組各管中加入IPTG溶液，使其終濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L，培養5 h后收集菌液，進行全菌SDS-PAGE電泳，對條帶進行分析，以獲得乳糖和IPTG的最佳誘導濃度。

1.2.5.4 誘導劑的選擇

對乳糖最佳誘導濃度和IPTG最佳誘導濃度下的菌液進行SDS-PAGE電泳，以判斷目的蛋白在何種誘導劑的誘導下表達量更高。

1.2.6 大規模誘導培養

將BL21(DE3)-pET28a Monellin按照 1∶100 的比例接種到含有KNA抗性的 LB液體培養基中，當其OD600值為0.6時加入IPTG母液使其終濃度為0.9 mmol/L，誘導5 h，通過SDS-PAGE驗證目的蛋白的表達。

1.2.7 甜味蛋白的提取純化

將誘導表達后的菌液進行低溫離心，隨后重懸菌體。于超聲波細胞破碎儀中破碎細胞，使蛋白游離出來。將超聲后的溶液離心10 min，收集上清液。取上清液與超聲沉淀分別制作蛋白電泳樣，確認目的蛋白的存在形式。

1.2.8 鎳柱親和層析

利用Monellin蛋白帶有His標簽采用鎳柱親和層析的方法對其進行純化，依次上60，100，200，500 mmol/L咪唑洗脫液進行梯度洗脫。流穿液、平衡液、洗脫液分別制樣，進行SDS-PAGE電泳，通過電泳結果判斷是否有未結合鎳柱的蛋白需要二次洗脫，以及蛋白被何種濃度的洗脫液洗脫下來，然后對含有大量蛋白的洗脫液進行透析，透析液為去離子水。

1.2.9 甜味閾值的判定

本實驗采用感官評定人員對甜味蛋白的稀釋溶液進行雙盲感官評定的方式來檢測甜味蛋白的甜味。將透析得到的蛋白進行凍干，在實驗開展前將上述蛋白樣品濃度配制成10，25，50，75，100，125，150，175，200 μg/mL，對照蔗糖濃度為20 mg/mL。選擇20名身體健康、味覺正常的志愿者，男女各一半，年齡在20～40歲之間。志愿者先品嘗作為對照的蔗糖溶液，再由低濃度到高濃度品嘗甜味蛋白溶液。在實驗過程中，志愿者不知溶液的濃度，每次含入2 mL的樣品溶液，大約20 s后吐出并用去離子水漱口，給出分值后間隔幾分鐘再進行下一濃度的評估。將每個濃度所得分數求平均值，將分數最接近2.0的樣品濃度定為甜味閾值。選擇分數最接近1.0的樣品濃度，對照蔗糖濃度與其比值即為相對甜度。

1.2.10 蔗糖和甜味蛋白對ICR小鼠血糖的影響

Raben等[14]及Fujita等[15]采用短期甜味刺激的方式研究人工甜味劑對機體能量的影響，得出人工甜味劑對機體葡萄糖代謝的無效性。由此推斷攝入甜味蛋白的小鼠血糖濃度低于攝入葡萄糖的小鼠，高于或近似于飲水組的小鼠血糖濃度。長期暴露的甜味刺激實驗中，非能量型人工甜味劑與能量型蔗糖一樣，低甜度能夠增加機體葡萄糖耐受性，高甜度反復刺激機體時則會降低機體血糖的耐受性[16]。

通過感官評價，25 μg/mL該人工合成的甜味蛋白甜度與對照組20 mg/mL蔗糖甜度相近。取25只RIO型健康正常生長期小鼠，饑餓處理12 h后，隨機分成5組，測定最低血糖濃度，記為0時血糖濃度。以25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去離子水和20 mg/mL蔗糖溶液對各組小鼠分別灌胃，檢測灌胃后0.5，1，1.5，2，3，4，5 h的血糖值，繪制血糖時間曲線，比較各個時間點血糖和血糖時間曲線的曲線下面積(AUC)。

2 結果與討論

2.1 BL21(DE3)-pET28a Monellin菌種的獲得

圖1 質粒圖譜及電泳結果Fig.1 The plasmid diagram and electrophoresis results注：A為pET28a-MNEI 質粒圖譜；B為陽性單菌落提取質粒核酸電泳結果：M表示250 bp DNA Ladder；1表示提取的質粒。

根據Monellin的核苷酸序列合成含有His標簽的質粒，質粒圖譜見圖1。將KNA篩選呈陽性的單菌落培養后提取質粒，進行核酸電泳，結果見圖1中B。核酸電泳在5600 bp處有條帶，證明電轉化成功，獲得目的菌種BL21(DE3)-pET28a Monellin，保存獲得菌種。

2.2 生長曲線

重組菌的生長曲線見圖2，取其OD600值為0.6時加入誘導劑，即其經搖床培養5 h后加入誘導劑。

圖2 重組BL21(DE3)-pET28a Monellin菌的生長曲線Fig.2 The growth curve of recombination BL21(DE3)-pET28a Monellin strains

2.3 乳糖和IPTG最適誘導時間

圖3 乳糖和IPTG最適誘導時間的確定Fig.3 Determination of the optimal induction time of lactose and IPTG注：A表示IPTG誘導時間；B表示乳糖誘導時間；M表示蛋白非預染Marker Ⅱ，1～8分別表示誘導0，1，2，3，4，5，6，7 h。

由圖3可知，誘導時間對Monellin的表達量有明顯的影響，經過Image J處理分析可知IPTG最佳誘導時間為5 h，乳糖的最佳誘導時間為4 h。

2.4 乳糖和IPTG最適誘導濃度

圖4 乳糖和IPTG最適誘導濃度的確定Fig.4 Determination of the optimal induction concentration of lactose and IPTG注：A表示IPTG誘導表達Monellin；B表示乳糖誘導表達Monellin；M表示蛋白非預染Marker Ⅱ；IPTG濃度1～7分別表示0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L；乳糖濃度1～7分別表示0，4，6，8，9，10，11 g/L。

由圖4可知，對不同誘導物濃度的菌液進行SDS-PAGE電泳發現誘導物濃度對Monellin的表達量有明顯的影響，經過Image J處理分析可知IPTG的最佳誘導濃度為0.9 mmol/L，乳糖的最佳誘導濃度為10 g/L。

2.5 誘導劑的選擇

乳糖和IPTG都能誘導大腸桿菌表達目的蛋白。以乳糖作為誘導物，誘使乳糖操縱子啟動蛋白表達，但乳糖會被細胞分解利用，隨著誘導時間增長，誘導效率會降低。IPTG憑借與乳糖相似的構造，同樣能夠誘使蛋白表達啟動，但細胞不分解IPTG，IPTG可以長久而持續地發揮效用[17]。

圖5 誘導劑的選擇Fig.5 The selection of inducers注：M表示蛋白非預染Marker Ⅱ，1表示10 g/L乳糖誘導，2表示0.9 mmol/L IPTG誘導。

由圖5可知，對10 g/L乳糖誘導4 h和0.9 mmol/L IPTG誘導5 h的菌液進行SDS-PAGE電泳，經過Image J處理分析可知10 g/L乳糖誘導的Monellin表達量低于0.9 mmol/L IPTG誘導的Monellin表達量，因此，相對于乳糖，選擇IPTG作為誘導劑。

2.6 Monellin在大腸桿菌中的表達形式

圖6 Monellin的表達形式Fig.6 Monellin's expression form注：M表示蛋白非預染Marker Ⅱ，1表示超聲上清，2表示IPTG誘導后全菌，3表示超聲沉淀。

由圖6可知，對誘導的蛋白進行SDS-PAGE電泳，經過圖像分析可知，Monellin主要存在于破碎細胞的上清液中，在沉淀中僅有少部分Monellin蛋白，故只需對上清液中的Monellin進行純化處理。

2.7 鎳柱純化結果

圖7 Monellin的鎳柱純化結果Fig.7 Monellin's nickel column purification results注：M表示Marker，1表示60 mmol/L咪唑洗脫蛋白收集液，2表示100 mmol/L咪唑洗脫液，3表示200 mmol/L咪唑洗脫液，4表示500 mmol/L咪唑洗脫液，5表示蛋白收集液，6表示純化前沉淀，7表示純化前上清液。

由圖7可知，100，200 mmol/L咪唑洗脫下了目的蛋白，100 mmol/L咪唑洗脫下的蛋白含量明顯比200 mmol/L咪唑洗脫下的多。60 mmol/L咪唑洗脫下的蛋白大多是雜蛋白，500 mmol/L洗脫下的雜蛋白含量較低，無明顯條帶。因此，下一步透析對象即為100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑洗脫液。

2.8 雙盲法評價甜味蛋白的甜度

選擇20位味覺正常的人口嘗甜味蛋白并進行感官評價，他們一致認為Monellin甜蛋白在最初幾秒不產生甜味覺，而后產生強烈甜味，但口感不如蔗糖，吐出后有干澀感。且濃度為25 μg/mL的甜味蛋白溶液甜度近似蔗糖對照溶液，即該甜味蛋白甜度等于800倍蔗糖甜度。100 μg/mL的蛋白濃度其分數最接近2.0，視為甜味閾值。

表1 評價不同濃度Monellin甜度平均值Table 1 Evaluation of the average sweetness of various concentration of Monellin

2.9 蔗糖和甜味蛋白對小鼠血糖的影響

圖8 給予甜味蛋白、蔗糖、去離子水后小鼠血糖濃度變化Fig.8 Changes in blood glucose concentration in mice after giving sweet protein＇ sucrose and deionized water注：A表示去離子水、20 μg/mL蔗糖溶液、25 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值變化曲線；20 mg/mL蔗糖溶液與25 mg/mL Monellin溶液血糖值比較，“**”表示p<0.01,“*”表示p<0.05；25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值變化曲線，各組間沒有顯著性差異(p>0.05)。

由圖8中A可知，給予蔗糖后小鼠血糖總體水平明顯高于給予去離子水組，給予Monellin后小鼠血糖水平高于去離子水組小鼠血糖水平明顯低于蔗糖組小鼠血糖水平。

由圖8中B可知，對3組小鼠分別給予25，37.5，50 μg/mL Monellin灌胃后，小鼠血糖水平沒有顯著性差異，即在一定范圍內，小鼠血糖水平不受Monellin濃度變化的影響。

3 結論

實驗由已知的具有Monellin相關基因的大腸桿菌誘導表達甜味蛋白Monellin。通過光電比濁計數法測得實驗條件下工程菌的對數生長期，在其OD600值約為0.6，即培養時長約為5 h后加入誘導劑。通過不同濃度的IPTG誘導與乳糖誘導表達Monellin，并設置取樣時間，通過SDS-PAGE比較蛋白的表達量，從而測得實驗條件下乳糖誘導該工程菌的最佳濃度是終濃度10 g/L，最佳時長是4 h，IPTG誘導該工程菌的最佳濃度是終濃度0.9 mmol/L，最佳誘導時長是5 h。對兩種不同誘導劑誘導的菌液進行SDS-PAGE電泳比較后發現，IPTG的誘導效果更好。所以最終采用0.9 mmol/L的IPTG作為誘導劑大規模誘導BL21(DE3)-pET28a Monellin菌種，表達Monellin后親和層析提純蛋白，將純化后的Monellin凍干后稀釋，進行雙盲實驗，以重量計，該重組Monellin蛋白甜度相當于800倍的蔗糖甜度，其甜味閾值為100 μg/mL。向各組小鼠分別灌入25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去離子水、20 mg/mL蔗糖溶液，與蔗糖相比，Monellin沒有顯著升高血糖的作用，并且在一定范圍內，Monellin對血糖的影響不隨其濃度的改變而發生變化。

4 展望

天然甜味蛋白與基因工程以及蛋白質工程的聯系日益密切，有關研究也愈加成熟。甜味蛋白Monellin雖然具有甜度高、引發糖類相關疾病的可能性小等優點，但是由于其對熱敏感，在酸堿條件下容易變性，導致Monellin難以實際應用于食品生產行業[18]。目前已經有研究人員[19]通過基因工程技術培養出了Monellin的突變體E23A 和 C41A，它們的熱穩定性強且甜味閾值較低，具有廣闊的商業化前景，為甜味蛋白Monellin的研究提供了新的思路與依據。隨著基因工程技術的進步和對甜味蛋白Monellin研究的深入，不同位點的氨基酸對甜味蛋白Monellin的影響將更加明朗，劉洋等[20]為了確認影響Monellin甜度的關鍵殘基，將位于循環區的殘基進行誘變分析后發現，連接天然Monellin兩條單鏈的親性環L23是甜味蛋白Monellin的一個甜度決定位點，為Monellin的分子設計提供了有效指導。本實驗室接下來將找到更符合工業化生產需要的突變體蛋白，從而全面地發揮Monellin的價值，以滿足市場對其產量和穩定性的需求。