食醋釀造用玉米化學(xué)成分變化對(duì)玉米赤霉烯酮提取的影響

高建偉，張浩楠,于麗萍,金吉東,賈文影,張舵

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.科菲特飼料(齊齊哈爾)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161200)

玉米發(fā)酵食醋是以玉米為主要原料，采用發(fā)酵和酶法相結(jié)合的技術(shù)制備而成[1]。原料發(fā)酵后，既可提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又可合成氨基酸、維生素等，顯著提高利用率[2-4]。玉米醋不但具有維生素、氨基酸等功能成分，而且具有抗衰老、抗心腦血管疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[5]。玉米富含的碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了天然培養(yǎng)基，微生物的代謝加速易導(dǎo)致玉米品質(zhì)發(fā)生變化，產(chǎn)生霉菌。玉米霉變不僅降低營(yíng)養(yǎng)和商品價(jià)值，還會(huì)對(duì)其食用性和安全性造成影響。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)最初發(fā)現(xiàn)于玉米赤霉病，世界范圍內(nèi)谷物和飼料均易污染。ZEN由Stob等[6]從禾谷鐮刀菌污染玉米中首次分離。全球有19個(gè)國(guó)家制定了食品中ZEN的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定食品中ZEN殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為200 μg/kg，我國(guó)規(guī)定玉米、小麥及制品中ZEN的含量不得超過60 μg/kg[7]。ZEN體外檢測(cè)方法主要有三類[8]，即化學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法[9]和時(shí)間分辨熒光技術(shù)檢測(cè)法。

近年來對(duì)ZEN等食品有害物檢測(cè)體系的研究領(lǐng)域非常活躍，包括超高效液相色譜[10]、快速免疫分析方法、高通量檢測(cè)技術(shù)、生物傳感器在線檢測(cè)技術(shù)等[11]。ELISA法具有快速、高通量等特點(diǎn)，適用于食品中ZEN的檢測(cè)，但是ELISA方法在樣品定量分析時(shí)常發(fā)生測(cè)定值偏差的現(xiàn)象，涉及原因眾多，樣品前處理就是原因之一。雖然可采用超聲波、超臨界等方案輔助提取,但有悖于ELISA快速簡(jiǎn)便的初衷，因此，在確保ELISA方法簡(jiǎn)便、快速的基礎(chǔ)上如何改善樣品前處理的影響，提高ELISA檢測(cè)的穩(wěn)定性備受學(xué)者關(guān)注。

本研究在樣品前處理階段選取ZEN為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以ELISA方法測(cè)定ZEN提取率為指標(biāo)，用UPLC-MS方法進(jìn)行驗(yàn)證，分析玉米樣品中化學(xué)成分的變化對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)影響提取效果的部分因子，進(jìn)而可以為現(xiàn)代快速檢測(cè)體系中簡(jiǎn)便高效的提取方法研究提供一些研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品：采自齊齊哈爾市梅里斯區(qū)雅爾塞鎮(zhèn)東風(fēng)村；ZEN、TMB：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇、碳酸氫鈉等：購(gòu)自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG：購(gòu)自碧云天生物公司；ZEN單克隆抗體：本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Victor酶標(biāo)儀 美國(guó)通用電器公司；馬弗爐 蘇州華隆工貿(mào)有限公司；脂肪測(cè)定儀 意大利VELP公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超高效液相色譜/四極桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米樣品前處理

根據(jù)甄玉萍等[12]的實(shí)驗(yàn)采用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎玉米，粉碎時(shí)間為180 s時(shí)，70%的甲醇水溶液提取，將處理后的玉米置于以下3種環(huán)境下保存：

通風(fēng)干燥：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，裝在干凈塑料袋中敞口置于實(shí)驗(yàn)室，溫度約為15～25 ℃，保持良好通風(fēng)。

低溫密封：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，裝在干凈塑封袋中，置于4 ℃冰箱中保存。

高溫高濕：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，用干凈的器皿盛裝，置于30 ℃恒溫箱中，并用飽和食鹽水控制濕度在75%左右。

在儲(chǔ)藏10，20，30，60，90 d用四分法取樣測(cè)定。

1.3.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

1.3.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取一定量樣品加入100 ppb ZEN標(biāo)準(zhǔn)品充分混勻，烘干后樣品置于15 mL離心管中，加入2 mL 70%甲醇水溶液進(jìn)行提取；渦旋混勻5 min，4000 r/min離心5 min；取上清液400 μL，加入600 μL稀釋液；渦旋混勻做待測(cè)樣品。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA優(yōu)化檢測(cè)條件操作[13]。

1.3.3 UPLC-MS檢測(cè)方法

1.3.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g粉碎樣品于50 mL離心管中加入20 mL 70%甲醇水溶液；用渦旋混合器混勻5 min，搖床振蕩30 min，室溫下4000 r/min離心10 min；取0.5 mL上清液于15 mL離心管中，加入9.5 mL PBS稀釋液；過0.22 μm濾膜，做待測(cè)樣品。

1.3.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

超高效液相色譜/四極桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀的色譜條件見表1，質(zhì)譜條件見表2。根據(jù)儀器操作要求加樣，以ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，ZEN出峰時(shí)間處的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 色譜條件Table 1 The chromatographic conditions

續(xù) 表

表2 質(zhì)譜條件Table 2 The mass spectrometry conditions

1.3.4 水分含量變化對(duì)ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法測(cè)定水分含量[14]。

1.3.5 粗脂肪含量變化對(duì)ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法測(cè)定脂肪含量[15]。

1.3.6 粗蛋白含量變化對(duì)ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)中的總氧含量[16]。

1.3.7 灰分含量變化對(duì)ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》[17]。

1.3.8 ZEN的回收提取實(shí)驗(yàn)

分別稱取上述1.3.4～1.3.7中的粉碎玉米樣品，添加100 ppb ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，充分均勻，烘干后分別采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法及UPLC-MS法聯(lián)合檢測(cè)，計(jì)算ZEN添加回收率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，進(jìn)行單因素方差分析，定義P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以濃度為0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，用Origin 軟件選擇四參數(shù)Logistic繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=2.7599/[1+(x/0.6616)0.7332]+0.0761，R2=0.9969，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法ZEN標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 ZEN standard curve of indirect competitive ELISA method

2.1.2 UPLC-MS法標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別以濃度為0，0.6，5.4，38，122 μg/kg的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，以9.8 min處出現(xiàn)的峰面積為縱坐標(biāo)，用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=144315x+316785，R2=0.9989，UPLC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 UPLC-MS法ZEN標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 ZEN standard curve of UPLC-MS method

2.2 UPLC-MS法測(cè)定玉米樣品中ZEN含量色譜圖

用UPLC-MS法測(cè)得的玉米樣品中ZEN含量的色譜圖見圖3，9.8 min處為ZEN的出峰時(shí)間。

圖3 UPLC-MS法測(cè)玉米樣品中ZEN含量色譜圖Fig.3 Chromatogram of ZEN content in corn samples measured by UPLC-MS

2.3 水分含量變化

圖4 不同儲(chǔ)藏溫度下玉米樣品中水分含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化Fig.4 The changes of moisture content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖4可知，在90 d的儲(chǔ)藏期內(nèi)，同一初始水分的樣品，30 ℃/飽和鹽溶液條件下玉米水分在22.12%～24.57%之間波動(dòng)，整體處于平穩(wěn)趨勢(shì)；4 ℃下的玉米水分整體呈下降趨勢(shì)，下降趨勢(shì)平緩；常溫下的玉米水分含量由24.57%下降到5.64%，下降趨勢(shì)顯著。3種環(huán)境下樣品水分含量不同，可能是由于儲(chǔ)存條件為30 ℃、75%飽和食鹽水條件下，提供了密閉空間的相對(duì)濕度，使得水分含量基本處于平穩(wěn)趨勢(shì)；4 ℃低溫冷藏下，水分略有下降，兩種情況下含水量的變化可能是樣品在儲(chǔ)藏期間環(huán)境與微生物的生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)有關(guān)[18]。

常溫條件下隨著時(shí)間延長(zhǎng)，玉米樣品的水分含量顯著下降，樣品敞口放置于空氣流通環(huán)境中，相對(duì)濕度較低，容器中儲(chǔ)存的玉米樣品上層暴露于空氣中，有利于水分的蒸發(fā)。因此，比較3種環(huán)境條件下水分含量下降趨勢(shì)為：常溫>4 ℃>30 ℃/飽和鹽溶液環(huán)境。

2.4 粗脂肪含量變化

圖5 不同儲(chǔ)藏溫度下玉米樣品中粗脂肪含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化Fig.5 The changes of crude fat content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖5可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，在常溫下玉米樣品粗脂肪含量降低量微小，在5.89%～6.24%之間波動(dòng)；4 ℃的玉米樣品粗脂肪從6.24%下降到2.75%，30 ℃的樣品粗脂肪含量從6.24%下降到1.02%，30 d下降速度加快且整體下降趨勢(shì)更顯著。可能與玉米樣品在儲(chǔ)存過程中水分含量引起的霉菌生長(zhǎng)有關(guān)。胡元森等[19]認(rèn)為玉米高水分促進(jìn)玉米中微生物活性急劇增加，微生物代謝活動(dòng)旺盛，玉米在儲(chǔ)存中霉菌生長(zhǎng)和繁殖過程會(huì)消耗部分脂肪，脂肪會(huì)被分解成游離的高級(jí)脂肪酸和甘油物質(zhì)等，導(dǎo)致粗脂肪含量呈降低趨勢(shì)，且水分含量越高、粗脂肪降低趨勢(shì)越顯著。

2.5 粗蛋白含量變化

圖6 不同儲(chǔ)藏溫度下玉米樣品中粗蛋白含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化Fig.6 The changes of crude protein content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖6可知，在90 d的儲(chǔ)藏期內(nèi)，3種條件下玉米樣品粗蛋白含量均無大幅度增減變化，在4 ℃和30 ℃/飽和鹽溶液環(huán)境下在20 d逐漸出現(xiàn)上升趨勢(shì)，30 d后呈平穩(wěn)趨勢(shì)。粗蛋白含量升高可能與霉菌滋生有關(guān)，儲(chǔ)藏過程中，霉菌生成的物質(zhì)一部分轉(zhuǎn)化為非蛋白氮，粗蛋白含量測(cè)定是以總氮乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)得到，非蛋白氮的增加可能會(huì)造成粗蛋白增加的假象[20]。殷晶晶等[21]提到在儲(chǔ)藏期間玉米中粗蛋白總量基本保持不變，而蛋白質(zhì)各組分會(huì)伴隨儲(chǔ)藏時(shí)間、溫濕度發(fā)生上升或下降趨勢(shì)。

2.6 灰分含量變化

圖7 不同儲(chǔ)藏溫度下玉米樣品中灰分含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化Fig.7 The changes of ash content in core samples with storage time at different storage temperatures

由圖7可知，在不同環(huán)境條件下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，灰分含量并沒有明顯波動(dòng)趨勢(shì)，在1.1%～1.3%之間呈穩(wěn)定趨勢(shì)。

2.7 ZEN添加回收率的分析

表3 ELISA回收率及UPLC-MS回收率Table 3 The recovery rates of ELISA and UPLC-MS

續(xù) 表

由表3可知，90 d儲(chǔ)存期內(nèi)，常溫條件下玉米樣品添加回收率在91.8%～94.7%之間，這種趨勢(shì)是由于水分含量大幅度下降，在玉米儲(chǔ)存過程中未引起霉變產(chǎn)生。30 ℃/飽和鹽溶液與4 ℃添加回收率變化趨勢(shì)大體一致，30 ℃下添加回收率整體高于4 ℃，在30～60 d儲(chǔ)存期間添加回收率持續(xù)升高，分別達(dá)到121.4%、112.4%。這可能是因?yàn)樗趾枯^高，玉米樣品在儲(chǔ)藏期內(nèi)發(fā)生霉變，霉菌的生長(zhǎng)繁殖消耗粗脂肪，鐮刀菌屬等產(chǎn)生ZEN，因此添加回收率會(huì)因霉變的產(chǎn)生、粗脂肪含量的減少呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。而在60 d后，毒素積累到一定量，由于引起霉變的不同霉菌數(shù)量和種類之間的拮抗作用，在后期儲(chǔ)存中，產(chǎn)生玉米赤霉烯酮的鐮刀菌屬等會(huì)逐漸減少，青霉屬、曲霉屬成為主要霉變的菌屬，因此ZEN的添加回收率又呈下降趨勢(shì)。而在90 d中灰分含量沒有因環(huán)境、儲(chǔ)存時(shí)間產(chǎn)生波動(dòng)，無法將灰分和ZEN提取間產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)系。丁斌鷹[22]在豆粕發(fā)霉過程中發(fā)現(xiàn)粗蛋白的含量變化沒有受到霉菌生長(zhǎng)及環(huán)境溫度因素的影響。齊德生等[23]研究玉米的品質(zhì)變化時(shí)也得出此結(jié)論。因此，我們推斷粗蛋白與ZEN的添加回收率無相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

在90 d的儲(chǔ)存期內(nèi)，水分含量在常溫、4 ℃冷藏條件下呈不同程度的下降趨勢(shì)。30 ℃/75%飽和食鹽水條件下水分含量變化幅度較小；高水分含量的玉米樣品隨儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)均發(fā)生不同程度霉變，消耗粗脂肪，生成游離的脂肪酸和甘油，玉米赤霉烯酮會(huì)隨著霉變的發(fā)生產(chǎn)生一定量的積累，儲(chǔ)存30 d后添加回收率增幅顯著增高；粗蛋白和灰分含量在不同儲(chǔ)存條件下無明顯變化。綜上所述，玉米樣品在不同儲(chǔ)存條件下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)水分含量、粗脂肪含量與ZEN的添加回收率均具有一定的相關(guān)性，影響程度為水分>粗脂肪。粗蛋白、灰分與ZEN的添加回收率無明顯相關(guān)性。本次實(shí)驗(yàn)確定了食醋釀造用玉米化學(xué)成分改變對(duì)ZEN添加回收率的影響因子，為ZEN的提取提供了化學(xué)因素影響的數(shù)據(jù)參考，為現(xiàn)代快速檢測(cè)體系中簡(jiǎn)便高效的提取方法研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為玉米食醋生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)提供了真菌毒素監(jiān)測(cè)方法。