食醋釀造用玉米化學成分變化對玉米赤霉烯酮提取的影響

高建偉，張浩楠,于麗萍,金吉東,賈文影,張舵

(1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.科菲特飼料(齊齊哈爾)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161200)

玉米發酵食醋是以玉米為主要原料，采用發酵和酶法相結合的技術制備而成[1]。原料發酵后，既可提高營養價值，又可合成氨基酸、維生素等，顯著提高利用率[2-4]。玉米醋不但具有維生素、氨基酸等功能成分，而且具有抗衰老、抗心腦血管疾病、增強機體免疫力等作用[5]。玉米富含的碳水化合物、蛋白質等物質，為微生物的生長繁殖提供了天然培養基，微生物的代謝加速易導致玉米品質發生變化，產生霉菌。玉米霉變不僅降低營養和商品價值，還會對其食用性和安全性造成影響。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)最初發現于玉米赤霉病，世界范圍內谷物和飼料均易污染。ZEN由Stob等[6]從禾谷鐮刀菌污染玉米中首次分離。全球有19個國家制定了食品中ZEN的限量標準，歐盟規定食品中ZEN殘留限量標準為200 μg/kg，我國規定玉米、小麥及制品中ZEN的含量不得超過60 μg/kg[7]。ZEN體外檢測方法主要有三類[8]，即化學檢測法、免疫學檢測法[9]和時間分辨熒光技術檢測法。

近年來對ZEN等食品有害物檢測體系的研究領域非常活躍，包括超高效液相色譜[10]、快速免疫分析方法、高通量檢測技術、生物傳感器在線檢測技術等[11]。ELISA法具有快速、高通量等特點，適用于食品中ZEN的檢測，但是ELISA方法在樣品定量分析時常發生測定值偏差的現象，涉及原因眾多，樣品前處理就是原因之一。雖然可采用超聲波、超臨界等方案輔助提取,但有悖于ELISA快速簡便的初衷，因此，在確保ELISA方法簡便、快速的基礎上如何改善樣品前處理的影響，提高ELISA檢測的穩定性備受學者關注。

本研究在樣品前處理階段選取ZEN為實驗對象，以ELISA方法測定ZEN提取率為指標，用UPLC-MS方法進行驗證，分析玉米樣品中化學成分的變化對ELISA檢測結果的影響，發現影響提取效果的部分因子，進而可以為現代快速檢測體系中簡便高效的提取方法研究提供一些研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品：采自齊齊哈爾市梅里斯區雅爾塞鎮東風村；ZEN、TMB：購自美國Sigma公司；甲醇、碳酸氫鈉等：購自天津市廣成化學試劑有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG：購自碧云天生物公司；ZEN單克隆抗體：本實驗室制備。

1.2 儀器與設備

Victor酶標儀 美國通用電器公司；馬弗爐 蘇州華隆工貿有限公司；脂肪測定儀 意大利VELP公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；超高效液相色譜/四極桿-軌道阱質譜聯用儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米樣品前處理

根據甄玉萍等[12]的實驗采用高速萬能粉碎機粉碎玉米，粉碎時間為180 s時，70%的甲醇水溶液提取，將處理后的玉米置于以下3種環境下保存：

通風干燥：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，裝在干凈塑料袋中敞口置于實驗室，溫度約為15～25 ℃，保持良好通風。

低溫密封：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，裝在干凈塑封袋中，置于4 ℃冰箱中保存。

高溫高濕：用四分法取一定量的粉碎玉米樣品，用干凈的器皿盛裝，置于30 ℃恒溫箱中，并用飽和食鹽水控制濕度在75%左右。

在儲藏10，20，30，60，90 d用四分法取樣測定。

1.3.2 間接競爭ELISA

1.3.2.1 樣品前處理

準確稱取一定量樣品加入100 ppb ZEN標準品充分混勻，烘干后樣品置于15 mL離心管中，加入2 mL 70%甲醇水溶液進行提取；渦旋混勻5 min，4000 r/min離心5 min；取上清液400 μL，加入600 μL稀釋液；渦旋混勻做待測樣品。

1.3.2.2 實驗方法

根據本實驗室建立的間接競爭ELISA優化檢測條件操作[13]。

1.3.3 UPLC-MS檢測方法

1.3.3.1 樣品前處理

準確稱取5 g粉碎樣品于50 mL離心管中加入20 mL 70%甲醇水溶液；用渦旋混合器混勻5 min，搖床振蕩30 min，室溫下4000 r/min離心10 min；取0.5 mL上清液于15 mL離心管中，加入9.5 mL PBS稀釋液；過0.22 μm濾膜，做待測樣品。

1.3.3.2 實驗方法

超高效液相色譜/四極桿-軌道阱質譜聯用儀的色譜條件見表1，質譜條件見表2。根據儀器操作要求加樣，以ZEN標準品濃度為橫坐標，ZEN出峰時間處的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

表1 色譜條件Table 1 The chromatographic conditions

續 表

表2 質譜條件Table 2 The mass spectrometry conditions

1.3.4 水分含量變化對ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法測定水分含量[14]。

1.3.5 粗脂肪含量變化對ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測定脂肪含量[15]。

1.3.6 粗蛋白含量變化對ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定蛋白質中的總氧含量[16]。

1.3.7 灰分含量變化對ZEN回收提取的影響

參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》[17]。

1.3.8 ZEN的回收提取實驗

分別稱取上述1.3.4～1.3.7中的粉碎玉米樣品，添加100 ppb ZEN標準品，充分均勻，烘干后分別采用間接競爭ELISA法及UPLC-MS法聯合檢測，計算ZEN添加回收率。

1.4 統計學分析

使用SPSS 19.0 統計軟件對實驗數據進行分析處理，進行單因素方差分析，定義P<0.05為差異顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 間接競爭ELISA法標準曲線

分別以濃度為0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg的ZEN標準品為橫坐標，以OD值為縱坐標，用Origin 軟件選擇四參數Logistic繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=2.7599/[1+(x/0.6616)0.7332]+0.0761，R2=0.9969，標準曲線見圖1。

圖1 間接競爭ELISA法ZEN標準曲線Fig.1 ZEN standard curve of indirect competitive ELISA method

2.1.2 UPLC-MS法標準曲線

分別以濃度為0，0.6，5.4，38，122 μg/kg的ZEN標準品為橫坐標，以9.8 min處出現的峰面積為縱坐標，用Excel繪制標準曲線，得到標準曲線方程：y=144315x+316785，R2=0.9989，UPLC-MS標準曲線見圖2。

圖2 UPLC-MS法ZEN標準曲線Fig.2 ZEN standard curve of UPLC-MS method

2.2 UPLC-MS法測定玉米樣品中ZEN含量色譜圖

用UPLC-MS法測得的玉米樣品中ZEN含量的色譜圖見圖3，9.8 min處為ZEN的出峰時間。

圖3 UPLC-MS法測玉米樣品中ZEN含量色譜圖Fig.3 Chromatogram of ZEN content in corn samples measured by UPLC-MS

2.3 水分含量變化

圖4 不同儲藏溫度下玉米樣品中水分含量隨儲存時間的變化Fig.4 The changes of moisture content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖4可知，在90 d的儲藏期內，同一初始水分的樣品，30 ℃/飽和鹽溶液條件下玉米水分在22.12%～24.57%之間波動，整體處于平穩趨勢；4 ℃下的玉米水分整體呈下降趨勢，下降趨勢平緩；常溫下的玉米水分含量由24.57%下降到5.64%，下降趨勢顯著。3種環境下樣品水分含量不同，可能是由于儲存條件為30 ℃、75%飽和食鹽水條件下，提供了密閉空間的相對濕度，使得水分含量基本處于平穩趨勢；4 ℃低溫冷藏下，水分略有下降，兩種情況下含水量的變化可能是樣品在儲藏期間環境與微生物的生長繁殖活動有關[18]。

常溫條件下隨著時間延長，玉米樣品的水分含量顯著下降，樣品敞口放置于空氣流通環境中，相對濕度較低，容器中儲存的玉米樣品上層暴露于空氣中，有利于水分的蒸發。因此，比較3種環境條件下水分含量下降趨勢為：常溫>4 ℃>30 ℃/飽和鹽溶液環境。

2.4 粗脂肪含量變化

圖5 不同儲藏溫度下玉米樣品中粗脂肪含量隨儲存時間的變化Fig.5 The changes of crude fat content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖5可知，隨著儲存時間的延長，在常溫下玉米樣品粗脂肪含量降低量微小，在5.89%～6.24%之間波動；4 ℃的玉米樣品粗脂肪從6.24%下降到2.75%，30 ℃的樣品粗脂肪含量從6.24%下降到1.02%，30 d下降速度加快且整體下降趨勢更顯著。可能與玉米樣品在儲存過程中水分含量引起的霉菌生長有關。胡元森等[19]認為玉米高水分促進玉米中微生物活性急劇增加，微生物代謝活動旺盛，玉米在儲存中霉菌生長和繁殖過程會消耗部分脂肪，脂肪會被分解成游離的高級脂肪酸和甘油物質等，導致粗脂肪含量呈降低趨勢，且水分含量越高、粗脂肪降低趨勢越顯著。

2.5 粗蛋白含量變化

圖6 不同儲藏溫度下玉米樣品中粗蛋白含量隨儲存時間的變化Fig.6 The changes of crude protein content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由圖6可知，在90 d的儲藏期內，3種條件下玉米樣品粗蛋白含量均無大幅度增減變化，在4 ℃和30 ℃/飽和鹽溶液環境下在20 d逐漸出現上升趨勢，30 d后呈平穩趨勢。粗蛋白含量升高可能與霉菌滋生有關，儲藏過程中，霉菌生成的物質一部分轉化為非蛋白氮，粗蛋白含量測定是以總氮乘以相應的蛋白質系數得到，非蛋白氮的增加可能會造成粗蛋白增加的假象[20]。殷晶晶等[21]提到在儲藏期間玉米中粗蛋白總量基本保持不變，而蛋白質各組分會伴隨儲藏時間、溫濕度發生上升或下降趨勢。

2.6 灰分含量變化

圖7 不同儲藏溫度下玉米樣品中灰分含量隨儲存時間的變化Fig.7 The changes of ash content in core samples with storage time at different storage temperatures

由圖7可知，在不同環境條件下，隨著儲存時間的增加，灰分含量并沒有明顯波動趨勢，在1.1%～1.3%之間呈穩定趨勢。

2.7 ZEN添加回收率的分析

表3 ELISA回收率及UPLC-MS回收率Table 3 The recovery rates of ELISA and UPLC-MS

續 表

由表3可知，90 d儲存期內，常溫條件下玉米樣品添加回收率在91.8%～94.7%之間，這種趨勢是由于水分含量大幅度下降，在玉米儲存過程中未引起霉變產生。30 ℃/飽和鹽溶液與4 ℃添加回收率變化趨勢大體一致，30 ℃下添加回收率整體高于4 ℃，在30～60 d儲存期間添加回收率持續升高，分別達到121.4%、112.4%。這可能是因為水分含量較高，玉米樣品在儲藏期內發生霉變，霉菌的生長繁殖消耗粗脂肪，鐮刀菌屬等產生ZEN，因此添加回收率會因霉變的產生、粗脂肪含量的減少呈現上升趨勢。而在60 d后，毒素積累到一定量，由于引起霉變的不同霉菌數量和種類之間的拮抗作用，在后期儲存中，產生玉米赤霉烯酮的鐮刀菌屬等會逐漸減少，青霉屬、曲霉屬成為主要霉變的菌屬，因此ZEN的添加回收率又呈下降趨勢。而在90 d中灰分含量沒有因環境、儲存時間產生波動，無法將灰分和ZEN提取間產生相關聯系。丁斌鷹[22]在豆粕發霉過程中發現粗蛋白的含量變化沒有受到霉菌生長及環境溫度因素的影響。齊德生等[23]研究玉米的品質變化時也得出此結論。因此，我們推斷粗蛋白與ZEN的添加回收率無相關性。

3 討論與結論

在90 d的儲存期內，水分含量在常溫、4 ℃冷藏條件下呈不同程度的下降趨勢。30 ℃/75%飽和食鹽水條件下水分含量變化幅度較小；高水分含量的玉米樣品隨儲存期的延長均發生不同程度霉變，消耗粗脂肪，生成游離的脂肪酸和甘油，玉米赤霉烯酮會隨著霉變的發生產生一定量的積累，儲存30 d后添加回收率增幅顯著增高；粗蛋白和灰分含量在不同儲存條件下無明顯變化。綜上所述，玉米樣品在不同儲存條件下，隨著儲存時間的延長水分含量、粗脂肪含量與ZEN的添加回收率均具有一定的相關性，影響程度為水分>粗脂肪。粗蛋白、灰分與ZEN的添加回收率無明顯相關性。本次實驗確定了食醋釀造用玉米化學成分改變對ZEN添加回收率的影響因子，為ZEN的提取提供了化學因素影響的數據參考，為現代快速檢測體系中簡便高效的提取方法研究提供了基礎，同時也為玉米食醋生產的各個環節提供了真菌毒素監測方法。