酶聯美拉德反應制備天然烤花生風味物質的研究

莊榮旭，馬穎川，賴升敬，羅妍，汪薇,2*

(1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣州 510225；2.廣東省香精香料(仲愷)工程技術研究中心，廣州 510225；3.華南農業大學 食品學院，廣州 510642；4.廣東省鹽業集團揭陽有限公司，廣東 揭陽 522000)

中國是世界上重要的花生生產國，總產量占世界花生產量的40%，居第一位，其中國內消費占總產量的95%以上?；ㄉ且环N廣受消費者歡迎的食品，特別是在焙烤過程中產生的特殊風味深受消費者喜愛[1-2]。

近年來，隨著人們消費觀念的改變及消費水平的提高，天然香精以其綠色、天然、安全、環保等特點日益受到人們的青睞?？净ㄉ憔鞘称飞a中一種重要的香味劑，能夠賦予食品特殊的烤花生香味，具有極大的市場潛力，可以廣泛應用于花生醬、花生味飲料、花生味蛋糕、花生味冰淇淋等食品中[3]。

目前有一些學者對花生風味物質進行了研究，黃文等用蛋白酶對脫脂花生進行酶解，然后與葡萄糖在丙二醇溶液中反應，以獲得焙烤花生的香味[4]；在Gannis等的專利中采用加熱浸泡過花生的丙三醇和水的混合溶液來制備花生風味[5]。但是這些研究中使用了有機溶劑，從安全的角度來看有所欠缺。陳文偉等采用花生粕酶解液與葡萄糖、氨基酸和硫胺素等在花生油中進行熱反應，制備了花生香精，并通過GC-MS檢測發現其主要呈香成分為吡嗪類、噻唑類、吡喃類化合物[6]。侯振建等的專利中通過熱反應制備了花生香精，具有濃郁的堅果香氣，適用于咸味食品[7]。而吳肖等則采用花生粕蛋白酶解液進行Maillard 反應后合成了肉類香味料[8]。

通過對花生風味物質的揮發性成分研究發現，主要風味成分除了吡嗪類化合物外，還有大量的醛類、酮類、酯類以及烯類化合物，其中苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是花生風味的主要貢獻物質[9-11]。

雖然美拉德反應在天然風味物質的制備上應用廣泛，但是在天然烤花生風味物質的制備上應用的并不是很多。本研究以花生為原料，采用酶聯美拉德反應，以期獲得天然烤花生風味物質。

1 材料與方法

1.1 材料

花生：市售；諾維信風味蛋白酶和Novozym 37071水解蛋白酶：購于廣州明曜商貿有限公司；Protease MSD、Protease A-2SD、Protamex、Lipase AY 30G、Lipase G50、Lipase MER、Lipase R：均由天野酶制劑(江蘇)有限公司上海分公司贈送；L-脯氨酸：購于衡水昌昊生物科技有限公司；L-精氨酸(≥99%)、L-丙氨酸(≥99%)、L-纈氨酸(≥99%)：購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；L-賴氨酸(98%)、L-甘氨酸(≥99%)、L-天門冬氨酸(≥99%)、L-谷氨酸(≥99.5%)、D-木糖(98%)：購于上海晶純生化科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：購于廣州一馬科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生預處理

將一定量的花生仁置于烘烤托盤中，然后放入遠紅外線食品烘爐中于120 ℃烘烤1 h，自然冷卻后，去紅衣，用打粉機進行打粉，然后裝于保鮮袋中密封，于4 ℃保存備用。

1.2.2 酶解

用天平稱取一定量的花生粉置于錐形瓶中，按一定的比例加入蒸餾水，搖勻后靜置10 min。待充分浸透后，置于90 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min。取出后冷卻至室溫，加入一定量的蛋白酶和脂肪酶，置于恒溫搖床中酶解一定的時間，取出，于90 ℃滅酶 10 min。自然冷卻至室溫后，于3000 r/min離心15 min，取上清，待用。

1.2.3 美拉德反應

取酶解液，加入一定量的氨基酸和糖，在一定的溫度下反應一定的時間后，于3000 r/min離心15 min，取上清，待用。

1.2.4 褐變程度的測定

取適當稀釋的樣液置于比色皿中，于420 nm的波長下，采用紫外分光光度計測定吸光值，其中吸光值反映出褐變程度。

1.2.5 感官評價標準

由5位感官評價成員對實驗所得樣品的風味進行評價，具體評分標準見表1。

表1 感官評價標準表Table 1 The sensory evaluation standard

2 結果與分析

2.1 酶解條件對酶解效果的影響

2.1.1 蛋白酶的種類對酶解效果的影響

蛋白酶可將花生中的蛋白質進行水解，產生多肽及氨基酸等風味物質。不同蛋白酶的酶解位點不同，會得到不同的酶解產物，從而得到具有不同風味的產物。

表2 蛋白酶的種類對酶解效果的影響Table 2 Effect of proteases＇ types on the enzymolysis effect

由表2可知，經諾維信風味蛋白酶酶解之后，其產物具有較濃郁的烤花生味和焦糖味，油脂味較淡，無不良的風味，且風味協調性好，優于其他幾種蛋白酶。這可能是因為諾維信風味蛋白酶同時具備內切酶和外切酶的活性，能得到較豐富的風味物質，較好地提升了酶解物的感官品質。綜合考慮，最適的蛋白酶以諾維信風味蛋白酶為宜。

2.1.2 脂肪酶種類對酶解效果的影響

脂肪酶的種類對酶解效果會產生較大影響，結果見表3。其中，Lipase MER和Lipase R的酶解產物都具有較濃郁的烤花生風味，且沒有明顯的油脂味。但是在風味的協調性上，Lipase MER要優于Lipase R，這可能是因為Lipase MER對中短鏈脂肪酸具有較強的水解能力，能產生烤花生風味的主要貢獻物質。綜合考慮，最適的脂肪酶以Lipase MER脂肪酶為宜。

表3 脂肪酶種類對酶解效果的影響Table 3 Effect of lipases＇ types on the enzymolysis effect

2.1.3 酶的比例對酶解效果的影響

表4 酶的比例對酶解效果的影響Table 4 Effect of ratios of proteases and lipases on the enzymolysis effect

由表4可知，當蛋白酶和脂肪酶的比例小于1∶1時，隨著脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均隨之增強，但是當比例大于1∶1時，隨著脂肪酶比例的增加，焦糖味和烤花生味均隨之減弱。因此可見，當加入的蛋白酶和脂肪酶的比例為1∶1時，烤花生味較濃郁，焦糖味和油脂味適中，風味協調性好。綜合考慮，復合酶的最適比例以1∶1為宜。

2.1.4 酶濃度對酶解效果的影響

表5 酶濃度對酶解效果的影響Table 5 Effect of content of enzymes on the enzymolysis effect

由表5可知，當酶濃度小于0.3%時，隨著酶濃度的增加，產物的烤花生味顯著增加，焦糖味和油脂味略有增加，風味協調性也隨之增加。但是當酶濃度大于0.3%時，烤花生味、焦糖味和油脂味均迅速下降，風味的協調性也隨之下降。綜合考慮，最適的酶濃度以0.30%為宜。

2.1.5 料液比對酶解效果的影響

表6 料液比對酶解效果的影響Table 6 Effect of solid-liquid ratios on the enzymolysis effect

由表6可知，當料液比小于1∶3時，隨著料液比的增加，烤花生味、焦糖味和油脂味迅速增加，風味協調性增強；而當料液比大于1∶3時，烤花生味、焦糖味和油脂味又呈現顯著下降的趨勢。這是因為料液比過低時，反應體系的流動性較差，不利于反應的發生；而料液比過高時，又會稀釋底物和產物濃度，減緩反應速度。綜合考慮，最適的料液比以1∶3為宜。

2.1.6 酶解時間對酶解效果的影響

表7 酶解時間對酶解效果的影響Table 7 Effect of enzymatic hydrolysis time on the enzymolysis effect

由表7可知，當酶解時間小于7 h時，隨著酶解時間的增加，產物的烤花生味、焦糖味及風味協調性均隨之上升；當酶解時間大于7 h時，隨著酶解時間的繼續增加，產物的烤花生風味和焦糖味稍有下降，油脂味明顯下降，而且風味協調性下降比較明顯，可能是因為酶解時間過長，將反應物中的大量油脂降解產生中短鏈脂肪酸所致。綜合考慮，最適的酶解時間以7 h為宜。

2.2 美拉德反應條件對花生類風味物質的影響

美拉德反應也稱羰氨反應，是一種非酶褐變，本質上是羰氨間的縮合反應，主要指的是醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質等含氮化合物的游離氨基之間發生的一系列反應，此反應會產生許多美拉德反應產物，如揮發性香氣物質、高活性且有紫外吸收的中間產物和復雜的黑色高分子聚合物蛋白黑素等。

通過控制原材料、溫度及加工方法，美拉德反應可制備各種不同風味、香味的物質。主要是采用還原糖和食品級的氮源如氨基酸、肽、蛋白質、植物水解蛋白及酵母提取物等多種物質混合加熱制備所需的食品風味物質。此外，美拉德反應產生的香精香氣飽滿、醇厚味濃郁及仿真度較高[12-17]，因此，在食品風味物質的制備上被廣泛應用。

2.2.1 氨基酸種類的影響

不同的氨基酸與還原糖通過美拉德反應能夠產生不同的特征風味，如臘肉、鵝肉、咖啡風味香精等。本研究選擇了脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸8種氨基酸分別與D-木糖和酶解液于110 ℃反應60 min，結果見表8。

表8 氨基酸種類對美拉德反應的影響Table 8 Effect of amino acids＇ types on the Maillard reaction

由表8可知，谷氨酸的加入有助于花生香味的增強，且油脂味微弱，風味協調性良好，感官評分總得分為13.5分，其他氨基酸反應后，所得產物的烤花生味較淡，且還會產生其他異味。此外，產物的吸光值可反映美拉德反應的褐變程度。谷氨酸所對應產物的吸光值最低，說明其褐變程度較低。綜合考慮，最適的氨基酸以谷氨酸為宜。

2.2.2 糖種類的影響

本實驗選取了蔗糖、D-木糖和葡萄糖分別參與美拉德反應，結果見表9。

表9 糖種類對美拉德反應的影響Table 9 Effect of saccharides＇ types on the Maillard reaction

由表9可知，D-木糖的加入有助于烤花生風味的產生，沒有產生雜味，風味協調性較好，感官評分總得分為14.5分；加入葡萄糖反應后的產物雖也沒有雜味，但其產物的花生風味較弱，感官評分總得分為10.5分。綜合考慮，最適的糖以D-木糖為宜。

2.2.3 谷氨酸添加量的影響

表10 谷氨酸添加量對美拉德反應的影響Table 10 Effect of additive amount of glutamate on the Maillard reaction

由表10可知，當谷氨酸的用量小于1.5%時，隨著谷氨酸用量的增加，烤花生風味物質的味道越來越濃，但是其添加量達到1.5%時，同時產生了明顯的異味，破壞了產物的風味協調性。當谷氨酸的用量大于1.5%時，隨著谷氨酸用量的增加，烤花生風味逐漸減弱，而酸味增強。綜合考慮，最適的谷氨酸用量以花生粉質量的1.0%為宜，其反應產物的吸光值為1.3，風味較好的產物吸光值大約在1.3～2.0范圍內。

2.2.4 D-木糖添加量的影響

表11 D-木糖添加量對美拉德反應的影響Table 11 Effect of additive amount of D-xylose on the Maillard reaction

由表11可知，當D-木糖添加量小于1.5%時，隨著D-木糖添加量的上升，烤花生風味越來越濃，異味逐漸消失；當D-木糖添加量大于1.5%時，烤花生風味逐漸變淡，焦糖味變重，所產生的風味類似花生糖。綜合考慮，最適的D-木糖用量以花生粉質量的1.5%為宜，其美拉德反應產物的吸光值為1.6，其風味較好的產物的吸光值大約在2.4～2.6范圍內。

2.2.5 反應溫度的影響

表12 反應溫度對美拉德反應的影響Table 12 Effect of reaction temperature on the Maillard reaction

由表12可知，當美拉德反應溫度低于110 ℃時，隨著反應溫度的上升，烤花生味越來越濃，油脂味微弱，協調性增加；當美拉德反應溫度高于110 ℃時，隨著反應溫度的上升，油脂味變得濃郁，且產生令人不愉快的異味。綜合考慮，最適的反應溫度以110 ℃為宜，其美拉德反應產物的吸光值為1.9，風味較好的產物吸光值大約在1.6～1.8范圍內。

2.2.6 反應時間的影響

表13 反應時間對美拉德反應的影響Table 13 Effect of reaction time on the Maillard reaction

由表13可知，當反應時間低于90 min時，隨著美拉德反應時間的增加，烤花生味變得越來越濃郁；當反應時間大于90 min時，隨著美拉德反應時間的增加，烤花生味變弱，且會產生異味。當反應時間為120 min時，會產生良好的番茄味。綜合考慮，美拉德反應的最適時間以90 min為宜。

3 結論與展望

本文通過酶聯美拉德反應可獲得天然烤花生風味物質?；ㄉ附庖旱淖罴阎苽錀l件為風味蛋白酶和Lipase MER的比例為1∶1，酶濃度為0.3%，料液比為1∶3，酶解溫度和時間分別為50 ℃和7 h；美拉德反應的最佳條件為谷氨酸和D-木糖的添加量分別為酶解液質量的1.0%和1.5%，反應溫度和時間為110 ℃和90 min，在此條件下得到的產物具有香濃的烤花生風味。

在研究的過程中偶然發現，用1.0%的谷氨酸和1.5% D-木糖與花生酶解液在110 ℃的條件下進行熱反應120 min，所得樣品具有良好的番茄味。用1.0%的谷氨酸和2.0% D-木糖與花生酶解液在110 ℃的條件下熱反應120 min，所得樣品具有良好的花生糖風味。因此，接下來可對天然花生糖風味物質和番茄風味物深入研究。此外，還可借助GC-MS、電子鼻、電子舌等現代高新實驗設備對制得的各種風味物質成分進行檢測分析，為烤花生風味物質的配制提供了理論依據。