南瓜果膠脫蛋白工藝及抗氧化活性研究

李曉娟，唐彥武，李柱剛，王珣*，趙曦，冷春旭，陸杰

(1.黑龍江省農業科學院生物技術研究所，哈爾濱 150028；2.黑龍江大學 生命科學學院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所，哈爾濱 150028；4.黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；5.黑龍江省南瓜育種與深加工工程技術研究中心，哈爾濱 150028)

果膠是一類存在于多種植物中的多聚糖類化合物，D-半乳糖醛酸為其主要組成部分[1-2]。果膠綠色天然、無毒環保的特點使其在食品領域中的應用日趨普遍[3-4]。果膠是一種常見的食品添加劑，主要功能是作為乳化劑、穩定劑、凝膠劑和增稠劑等改善食品和調味制品的外觀、組織、口感以及生物利用度等[5-7]。果膠在日常飲食中隨處可見，在調味制品(果醬、醬料等)、烘焙產品(面包、糕點等)、飲品(酸奶、乳酸飲料等)和休閑食品(果凍、軟糖等)中都有廣泛的應用[8]。有學者從甜菜、檸檬、山竹、柑橘、木瓜等植物殘渣中提取果膠，但隨著果膠在食品領域的需求增加，尚需要從國外進口[9-13]。籽用南瓜果肉資源，在取食南瓜籽后常作為飼料或被廢棄，可作為開發新型果膠的原料[14-17]。研究證實，南瓜果膠具有明顯的抗氧化，吸附重金屬保護細胞等功效[18]。

目前果膠的提取方法很多，但果膠提取中往往伴隨蛋白質等雜質，蛋白質的存在不僅影響果膠的純度和結構，甚至可能影響果膠的生物活性，因而蛋白質的脫除是果膠純化的關鍵步驟[19-22]。目前常用的脫蛋白工藝有Sevag法、TCA法、酶法和鹽析法等，與單一方法相比，聯合工藝效果更好[23]，課題組前期通過比較Sevag法和TCA法，確定TCA法更適合南瓜果膠脫蛋白。綜上所述，本文以籽用南瓜果肉為原料，分離南瓜粗果膠，將酶法與TCA法相結合的ETCA法應用于粗果膠脫蛋白工藝的研究，并對脫蛋白前后果膠樣品的抗氧化活性進行檢測，考察南瓜果膠作為食品添加劑的可行性，為南瓜果膠功能食品的研發提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜品種為“金龍瓜1號”：2018年10月采自黑龍江省農業科學院畜牧所園區，采收后運回實驗室當天處理；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 南瓜粗果膠的分離

南瓜去籽、洗凈、切塊，滅酶，烘干破碎，得到南瓜粉(60目)。精確稱取適量南瓜粉，按1∶30(m/V)加入蒸餾水，放入超聲儀中，80 ℃提取1 h。將提取液真空濃縮至原來的1∶4(V/V)，溫度降至常溫后，放入4倍體積95%乙醇，過濾所得固形物冷凍干燥待測。

1.2.2 果膠脫蛋白率測定[24]

以考馬斯亮藍G-250為染料液，預制濃度為0.1 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)母液，分別取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL母液放入具塞試管中，加水定容1 mL，分別放入定容后5倍體積染料液，搖勻后，反應5 min。以蒸餾水作為空白對照，測定595 nm處各樣品的吸光度。y=0.006821x+0.03308，R2=0.9972(y為吸光值，x為BSA含量)。

取一定濃度樣品溶液1 mL，替代BSA，后續按上述方法進行，計算蛋白質含量。

果膠脫蛋白率按公式(1)計算：

脫蛋白率/%=(C前-C后)/C前×100。

公式(1)

式中：C前為脫蛋白前蛋白含量(μg/mL)；C后為脫蛋白后蛋白含量(μg/mL)。

1.2.3 果膠留存率測定[25]

將0.1 mg/mL半乳糖醛酸標準液配制成濃度為10，20，30，40，50，60，70，80 μg/mL的梯度標準液，加入6 mL濃硫酸，緩慢振蕩，靜置電熱恒溫水槽中90 ℃，15 min，反應結束后冷卻至室溫。加入1.5 mg/mL咔唑無水乙醇0.2 mL，混合均勻，避光反應2 h。以1 mL蒸餾水替代標準液作為空白，按相同步驟操作，檢測530 nm波長下各樣品的吸光值。y=0.006963x+0.003286，R2=0.9983(y為吸光值，x為半乳糖醛酸含量)。

取一定濃度樣品1 mL，替代半乳糖醛酸，后續按上述方法進行，計算半乳糖醛酸含量。

果膠留存率按公式(2)計算：

果膠留存率/%=M后/M前×100。

公式(2)

式中：M前為脫蛋白前果膠含量(μg/mL)；M后為脫蛋白后果膠含量(μg/mL)。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 酶用量

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，分別加入0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%(W/V)的木瓜蛋白酶，將樣品置于50 ℃電熱恒溫水槽2 h，再于100 ℃ 10 min使酶失活，待樣品溫度下降至常溫，加4% TCA 20 mL，混勻，劇烈振蕩30 min后靜置，20 min后離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，檢測果膠和蛋白質含量，計算果膠脫蛋白率和留存率，試驗重復3次。

1.2.4.2 酶解溫度

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，加入0.5%(W/V)的酶，分別置于35，40，45，50，55 ℃電熱水槽2 h，此后沸水滅酶10 min，待反應液溫度下降至常溫，加入4% TCA 20 mL，強力振蕩30 min，放置20 min離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，以硫酸咔唑法檢測果膠含量，Bradford法檢測蛋白質含量，計算果膠脫蛋白率和留存率，試驗重復3次。

1.2.4.3 酶解時間

精確量取40 mg/mL南瓜果膠樣液40 mL，加入0.5%(W/V)的酶，置于50 ℃電熱恒溫水槽0.5，1，1.5，2，2.5 h，此后沸水滅酶10 min，待樣品溫度下降至常溫，加入4% TCA溶液 20 mL，強力振蕩30 min，放置20 min離心(4000 r/min，10 min)，取出上層溶液稀釋至一定濃度后，檢測果膠和蛋白質含量，計算果膠脫蛋白率和留存率，試驗重復3次。

1.2.5 正交試驗設計

選取酶用量、酶解溫度和酶解時間3個變量，結合1.2.4的試驗結果，設計L9(34)試驗優化ETCA法，采用綜合加權平均法進行評分，其因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.6 透析

將脫蛋白后樣品裝入預先處理好的透析袋內，先后采用流水和蒸餾水透析48 h和24 h，期間換3次蒸餾水。取出透析果膠溶液，濃縮至1/4體積，待溫度降至常溫，放入4倍量無水乙醇并不斷攪拌，放置1 h，過濾，45 ℃烘干，獲得脫蛋白南瓜果膠樣品。

1.2.7 羥基自由基(·OH)清除能力測定[26]

不同濃度0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL脫蛋白前后南瓜果膠液各取1 mL，依次分別加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻。放入37 ℃電熱恒溫水槽中水浴15 min，取出，冷卻至室溫。以VC作為陽性對照，檢測510 nm波長處各溶液的吸光度，試驗重復3次。清除率計算公式如下：

羥自由基清除率/%=[A空白-(A樣品-A對照)]/A空白×100。

公式(3)

式中：A空白為空白對照吸光值，A樣品為樣品吸光值，A對照為不加顯色劑H2O2。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對脫蛋白作用的影響

采用ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，探討酶用量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，W/V)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖1 酶用量對脫蛋白作用的影響Fig.1 The effect of additive amount of enzyme on deproteinization

由圖1可知，伴隨酶用量的增多，脫蛋白率快速上升而后趨于平穩。原因可能是當酶用量在0.1%～0.5%時，底物與木瓜蛋白酶接觸面積會隨酶用量的增多而增長，表現為果膠脫蛋白率快速上升；當酶用量超過0.5%時，蛋白脫除率變化不顯著，可能是由于有限的底物限制了木瓜蛋白酶進一步反應。隨著酶的增多，果膠留存量持續下降，當酶用量超過0.5%時，果膠含量下降速度由慢變快，可能是由于在大量酶的作用下，蛋白迅速發生水解，某些果膠也改變了構象，與蛋白一同被分離出來。綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率選擇0.4%～0.6%作為正交試驗酶用量的水平范圍。

2.1.2 酶解溫度對脫蛋白作用的影響

采用酶聯合三氯乙酸法對南瓜果膠進行脫蛋白，探討酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖2 酶解溫度對脫蛋白作用的影響Fig.2 The effect of enzymolysis temperature on deproteinization

由圖2可知，當溫度范圍處于35～50 ℃之間，果膠脫蛋白率呈現不斷上升趨勢，當溫度為50 ℃時，果膠脫蛋白效果最好，高出50 ℃后，果膠脫蛋白率稍有下滑趨勢，大概與酶作用在最適溫度時酶活力達到最大有關，高于最適溫度，酶活力開始降低，過高溫度會導致木瓜蛋白酶不能充分發揮作用。果膠留存率受酶解溫度的影響不大，綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率，選擇45～55 ℃作為正交試驗酶解溫度的水平范圍。

2.1.3 酶解時間對脫蛋白作用的影響

采用ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，探討酶解時間(0.5，1，1.5，2，2.5 h)對果膠脫蛋白作用的影響。

圖3 酶解時間對脫蛋白作用的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on deproteinization

由圖3可知，在0.5～2 h時，隨著時間的增長，果膠脫蛋白率不斷增加，果膠留存率緩慢下降。分析原因可能是酶解時間較短時，酶不能與底物充分接觸，果膠中蛋白質溶出緩慢。當酶解時間超過2 h時，果膠脫蛋白率基本保持不變，果膠留存率持續降低，可能是由于此時蛋白脫除過程基本完成，進一步延長時間反而導致果膠開始降解，綜合考慮果膠留存率和脫蛋白率，選擇1.5～2.5 h作為正交試驗酶解時間的水平范圍。

2.2 正交試驗結果

單因素試驗結果表明試驗中選取的3個因素對果膠脫蛋白都有一定作用。通過1.2.4選取范圍進行正交試驗以獲得果膠脫蛋白最優工藝，以綜合評價率為指標，分析脫蛋白作用。

表2 正交試驗直觀分析表Table 2 The orthogonal experiment intuitive analysis table

續 表

表3 正交試驗方差分析表Table 3 The analysis of variance table of orthogonal test

由表2可知，3個因素中，酶用量的極差(R)最大，酶解溫度的極差最小，因而對果膠脫蛋白作用影響從大到小依次是A>C>B。由均值(K)可知，果膠脫蛋白各參數的最優水平為A2B2C1。由表3可知，方差分析結果與直觀分析結果相吻合，其中酶用量對果膠脫蛋白所起作用最顯著。因此，南瓜果膠的ETCA法脫蛋白最優參數為：酶用量0.5%，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h。

2.3 驗證試驗

根據正交試驗所得脫蛋白最佳工藝條件，選擇ETCA法對南瓜果膠脫蛋白，試驗重復3次。

表4 驗證試驗結果Table 4 The results of verification experiment

由表4可知，脫蛋白率為83.28%，果膠存留率為76.40%，表明ETCA法優化出的南瓜果膠脫蛋白參數可行。

2.4 抗氧化活性結果

羥基自由基(·OH)是最活躍的自由基，差不多所有活細胞中與生命有關的大分子都可以與此自由基產生作用而造成氧化性損傷，使組織細胞病變，進而加速機體的衰老。因此，尋求合適的物質消除這一自由基尤為關鍵。本試驗采用不同濃度(0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/mL)脫蛋白前后南瓜果膠樣品溶液作為清除劑，進而評價自由基清除活性。

圖4 羥基自由基(·OH)試驗結果Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability test results

由圖4可知，南瓜果膠溶液濃度在一定范圍內，隨著果膠濃度的增加，對羥基自由基(·OH)的清除作用越來越明顯，而后趨于平穩狀態，結果顯示南瓜果膠有一定的抗氧化作用。相同濃度VC溶液和脫蛋白前后樣品清除·OH自由基作用對比結果：VC>脫蛋白后果膠>脫蛋白前果膠。當樣品濃度為20 mg/mL時，脫蛋白后樣品清除率為67.18%±2.59%，脫蛋白前樣品清除率為47.87%±1.91%，脫蛋白后果膠樣品抗氧化效果更好。

3 結論

本試驗以脫蛋白率和果膠存留率為指標，利用單因素試驗方法研究了不同影響因素對ETCA法脫蛋白作用的影響，以綜合加權平均法計算綜合評價率，運用正交試驗并優化了ETCA法的除蛋白過程，驗證試驗結果表明過程參數切實可行。在一定濃度范圍內，羥基自由基清除試驗證明南瓜果膠具有良好的抗氧化活性。本研究結果可為南瓜果膠工業開發提供技術支持，從而使南瓜果膠更有效地應用和服務于食品與調味品行業，同時推動南瓜資源的進一步開發利用。