超聲波輔助溶劑法提取沙棘果油工藝優化及其抗氧化活性研究

林可，王斌*，張丹丹，葛正凱，薛丕衛,2

(1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；2.新疆伊犁金康蘇沙棘產業開發有限公司，新疆 伊犁 835000)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，屬胡頹子科(Elaeagnaceae)落葉灌木或小喬木，又名醋柳、黑刺、酸刺，主要在東經2°～123°，北緯 27°～69°之間亞歐大陸的溫帶地區[1]。沙棘耐寒，耐旱，耐風沙，耐土壤貧瘠，適合在我國西北、華北、東北、西南等地區種植。中國是沙棘的發源地，沙棘的種植面積和產量占世界總量的90%以上。而新疆作為中國沙棘的故鄉，其沙棘總產量達到全國的50%以上。沙棘的根、莖、葉、花、果實都含有生理活性物質，其中，沙棘果實中的天然活性成分含量最高，具有良好的藥用和保健價值[2-3]。作為沙棘果實中最有價值的組分之一，沙棘油富含維生素、胡蘿卜素、黃酮類化合物、脂肪酸、葉酸、8種必需氨基酸和多種微量元素等，對燒傷、潰瘍等疾病有特殊療效，同時還具有抗輻射、抗衰老、調節人體免疫力、緩解動脈粥樣硬化等功效，使其在醫藥、保健食品、美容化妝品等領域被廣泛應用，具有巨大的潛在應用價值[4]。

當前，常用的提取沙棘果油油脂的方法主要有超臨界CO2萃取法、有機溶劑萃取法、水代法、水酶法、超聲波輔助法和微波輔助法等[5-6]。有機溶劑萃取根據相似相溶原理，選擇與物料極性相近的有機溶劑最大程度地分離油脂，在工業生產中是一種相對簡單的油脂提取方法。超聲波的作用主要是空化效應，在超聲波作用下，空化泡能瞬間漲大并破裂，產生高達幾千個大氣壓瞬時壓力，同時伴有強大沖擊波和微聲流，從而將細胞壁結構破壞，胞內油脂得以釋放，提高出油率[7-9]。近年來，超聲波輔助與有機溶劑相結合的提取技術因具有提取時間短、效率高、可提高油脂品質等優點，廣泛應用于天然產物的提取[10]。研究表明，超聲波的使用能夠促進有機溶劑提取油脂的效果進一步提高。

新疆沙棘資源豐富，沙棘果具有極高的生物活性。本研究通過單因素試驗和正交試驗，采用超聲波輔助有機溶劑提取新疆沙棘果油，并探討了提取沙棘果油的抗氧化效果，為新疆地區沙棘果油的提取與應用提供了技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的沙棘原漿來源于新疆伊犁金康蘇沙棘產業開發有限公司，用車載冰箱運輸，于-20 ℃保藏；石油醚(60～90 ℃)、正己烷、乙酸乙酯：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、DPPH溶液、ABTS溶液、過硫酸鉀、結晶紫、硫酸亞鐵、磷酸、檸檬酸、過氧化氫、VC：均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ250-DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；日本YAMATO旋轉蒸發儀 重慶雅馬拓科技有限公司；津騰溶劑過濾器 天津市津騰實驗設備有限公司；756PC紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙棘果油提取工藝流程

沙棘果實→擠壓破碎→分離沙棘籽→沙棘原漿→加有機溶劑→超聲輔助提取(多次)→靜置分離→旋轉蒸發回收有機溶劑→燒瓶冷卻至室溫稱重→差量法獲得沙棘果油質量。每組試驗平行3次，采用最小顯著差異的方法對單因素試驗進行方差分析。

1.3.2 提取率的計算

式中：R是沙棘果油的提取率，%；M1是沙棘果油和蒸餾燒瓶的質量，g；M2是蒸餾燒瓶的質量，g；M是沙棘原漿的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

稱量沙棘原漿10.00 g，在超聲波功率為200 W、超聲頻率為45 kHz的條件下，按照上述試驗步驟，以料液比為1∶6 (g/mL)在樣品中分別加入有機溶劑石油醚、正己烷和乙酸乙酯，提取時間設定為20 min，以沙棘果油的提取率確定最佳的提取溶劑。

最佳提取溶劑確定后，以提取溫度40，45，50，55，60 ℃，提取時間15，20，25，30，35 min，料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)，提取次數1，2，3，4次，采用單因素試驗研究這4個因素對沙棘果油提取率的影響，每組試驗平行3次。

1.3.4 正交試驗

以單因素試驗為基礎，選取提取溫度、提取時間、料液比、提取次數設計4因素3水平的正交試驗。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 沙棘果油抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考史亞男等[11]的方法，用無水乙醇分別配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，準確吸取待測溶液2.0 mL，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻，在黑暗條件下靜置30 min。以無水乙醇調零，并用紫外分光光度計測定其在波長為517 nm處的吸光值A樣品；測定樣品溶液2.0 mL與無水乙醇2.0 mL混合液的吸光值A對照；最后測定2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL無水乙醇的吸光值A空白。每組試驗測定3次，并以平均值繪圖。以VC為陽性對照，使用前以蒸餾水配制質量濃度與沙棘果油相同的對照液。用蒸餾水為空白對照，每個濃度測定3次，計算公式如下：

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

參考崔同等[12]的方法，在室溫下，先以5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)與88 μL的K2S2O3溶液(140 mmol/L)充分混合，在黑暗條件下靜置過夜，得到ABTS儲備液。之后用無水乙醇稀釋，并在波長為734 nm下測定，使稀釋后的儲備液的吸光度為0.70±0.02。用無水乙醇配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，取不同的待測溶液100 μL，并加入0.9 mL的ABTS稀釋液，使其反應1 min，測定吸光度為A樣品；測定稀釋后的ABTS溶液的吸光度為A對照。每個濃度測定3次，并以平均值繪圖。將VC作為陽性對照，使用前以蒸餾水配制質量濃度與沙棘果油溶液相同的對照液。用蒸餾水做空白對照，每個濃度測定3次。上述的檢測波長均為734 nm，計算公式如下：

1.3.5.3 羥自由基清除能力

參考高燕[13]的方法，用無水乙醇分別配制不同濃度的沙棘果油待測溶液(2，4，8，16，20 mg/mL)，在25 mL的具塞比色管中分別加入0.3 mL結晶紫溶液(0.4 mmol/L)、0.6 mL H2O2溶液(2.0 mmol/L)和1.2 mL FeSO4(1.0 mmol/L)溶液。將上述溶液用磷酸-檸檬酸緩沖溶液(pH 4.0)定容至10 mL，充分振蕩搖勻后靜置30 min，測其吸光度Ab，同時測定不加H2O2的吸光度A0，測定波長為580 nm。在加H2O2之前分別在上述體系中加入不同濃度的待測液2 mL，測定其吸光度為As。每個濃度測定3次，并以平均值繪圖。以VC作為陽性對照，使用前用蒸餾水配制質量濃度與沙棘果油溶液相同的對照液。用蒸餾水做空白對照，每個濃度測定3次，計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 有機溶劑對沙棘果油提取率的影響

根據“相似相溶”原理，正己烷、石油醚、乙酸乙酯和乙醇等有機溶劑被廣泛用于提取植物油脂。本研究以沙棘果油提取率為指標，依據溶劑的介電常數和脫溶難易程度考察了3種常用的有機溶劑即正己烷、石油醚、乙酸乙酯對沙棘果油提取率的影響。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲溫度45 ℃、超聲處理時間20 min、料液比1∶6 (g/mL)、提取次數為1次的條件下，考察了正己烷、石油醚、乙酸乙酯對沙棘果油提取率的影響，結果見圖1。

圖1 有機溶劑的影響Fig.1 The effect of organic solvents

由圖1可知，采用不同有機溶劑提取沙棘果油時，提取率存在顯著差異，其中石油醚的提取率最高，達到1.1%。正己烷的提取率為0.4%，提取效果最差。因此，本研究以石油醚為萃取溶劑用于后期沙棘果油的提取。

2.1.2 超聲處理時間對沙棘果油提取率的影響

超聲處理時間的增加可以使原料和溶劑充分接觸，從而加快油脂溶出，提高提取率。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲溫度45 ℃、提取次數為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時，考察了不同超聲處理時間15，20，25，30，35 min對沙棘果油提取率的影響，結果見圖2。

圖2 超聲時間的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time

由圖2可知，由于原料中提取物的含量是一定的，隨著超聲時間的延長，超聲波對物料的作用更加充分，沙棘果油的提取率增大，當達到一定時間后，提取率反而下降，可能是由于過長的超聲時間會引起熱效應，導致有機溶劑揮發，并發生了油脂夾帶的現象[14]。結果表明，超聲處理時間為25 min時沙棘果油的提取率可達0.7%。因此，選取25 min作為最佳超聲處理時間。

2.1.3 超聲溫度對沙棘果油提取率的影響

分子動能大小受溫度的影響，升溫可以加快分子運動速度，促進分子擴散。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時間25 min、提取次數為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時，考察不同超聲溫度40，45，50，55，60 ℃對沙棘果油提取率的影響，結果見圖3。

圖3 超聲溫度的影響Fig.3 The effect of ultrasonic temperature

由圖3可知，當超聲溫度從40 ℃提高到50 ℃時，沙棘果油的提取率不斷增加。這是因為溫度的升高加快了有機溶劑和油脂分子的運動速度，促進了油脂的擴散。但繼續增加超聲溫度，沙棘果油的提取率反而下降，這可能是由于溫度接近有機溶劑石油醚的沸點時，部分石油醚揮發，沙棘果油提取率下降，或者在石油醚揮發過程中夾帶了一些揮發性物質。因此，選取50 ℃作為最佳超聲溫度。

2.1.4 料液比對沙棘果油提取率的影響

提取率受料液比的影響，料液比過低或過高都會造成提取率下降。在提取過程中，料液比過低不易溶出提取物，過高則會浪費溶劑同時也會使提取物被稀釋。因此，為了提高提取率，選擇最佳的料液比至關重要。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時間25 min、超聲溫度50 ℃、提取次數為1次的條件下，以石油醚為提取溶劑，考察不同料液比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 (g/mL)對沙棘果油提取率的影響，結果見圖4。

圖4 料液比的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio

由圖4可知，在料液比由1∶2增加到1∶6時，沙棘果油的提取率顯著提高，料液比為1∶6時提取率達到0.6%。繼續增加料液比，沙棘果油的提取率反而下降。這是由于石油醚用量增加，沙棘原漿與石油醚的濃度差增大，濃度差越大，沙棘果油越容易溶出，當石油醚用量增加到一定值后，由于沙棘原漿中油脂含量逐漸減少，因此石油醚的增加不能使更多的油脂溶出，并且還會導致回收時間的延長，造成沙棘果油的浪費。因此，選取1∶6作為最佳料液比。

2.1.5 提取次數對沙棘果油提取率的影響

隨著提取次數的增加，原料在溶劑中得到充分溶解。但次數過多不僅浪費溶劑，而且提取時間也會相應增長，從而導致提取成本增加。本研究在沙棘原漿10.00 g、超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、超聲時間25 min、超聲溫度50 ℃，以石油醚為提取溶劑，料液比為1∶6時，考察不同提取次數，1，2，3，4次對沙棘果油提取率的影響，結果見圖5。

圖5 提取次數的影響Fig.5 The effect of extraction times

由圖5可知，在超聲功率為200 W、超聲頻率為45 kHz、超聲處理時間為25 min、超聲溫度為50 ℃時，以料液比1∶6對沙棘原漿進行多次提取，比較提取率，在對沙棘原漿提取2次時，提取率為0.9%，隨著提取次數的增加，提取3次和4次時提取率均為1.0%，僅比提取2次時提高了0.1%。這可能是因為在提取2次時沙棘果油已基本溶出，再增加提取次數并不能溶出更多的沙棘果油。并且隨著提取次數的增多，濾液濃縮時間會增長，一定程度上給濃縮帶來困難。因此，選取2次作為最佳提取次數。

2.2 沙棘果油提取條件的正交試驗優化

正交試驗結果見表2，由極差分析結果可以看出，各因素對沙棘果油提取率的影響有明顯差別，其影響順序為B>D>C>A，即提取時間>提取次數>料液比>提取溫度。各主次因素最優水平組成最優提取工藝條件，為A3B2C1D2，即提取溫度55 ℃、提取時間25 min、料液比1∶4、提取次數2次為最優提取工藝組合。

表2 沙棘果油提取L9(43)正交試驗優化結果Table 2 The optimized results of orthogonal test L9(43)for extraction of sea buckthorn fruit oil

以石油醚為提取溶劑，在超聲功率200 W、超聲頻率45 kHz、提取溫度50 ℃、提取時間25 min、料液比1∶4、提取次數2次的條件下對沙棘果油進行提取，提取率達1.1%，優于表2中每組提取結果，因此，A3B2C1D2為最佳提取工藝組合。

2.3 沙棘果油抗氧化活性測定

2.3.1 沙棘果油對DPPH自由基的清除能力

1,1-二苯基-2-苦基苯肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)是一種穩定的有機自由基和具有特征的紫紅色團吸收峰，當自由基清除劑存在時，與DPPH的單電子配對從而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與所接收的電子數呈定量關系，因此可用分光光度法進行測定分析[15]。

圖6 沙棘果油和VC對DPPH的清除率Fig.6 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on DPPH free radical

由圖6可知，在選擇的沙棘果油溶液濃度范圍內，DPPH自由基清除率與濃度呈正相關，在濃度范圍為0～10 mg/mL時，清除率隨著濃度增加而快速增加，在濃度范圍為10～20 mg/mL時，清除率增加相對緩慢且最終趨于平衡，最終的清除率達到96.5%，與VC清除DPPH自由基的清除率相近。而在同樣的濃度范圍內，DPPH自由基清除率隨著VC濃度的增加無明顯變化，接近100%。在DPPH自由基清除試驗中，VC的IC50值為0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為4.47 mg/mL，是VC的0.22倍，此時所需的沙棘原漿為406.36 mg。

2.3.2 沙棘果油對ABTS自由基的清除能力

ABTS法是根據對電子的轉移和對有色物質的還原來測定抗氧化活性的。在ABTS自由基反應中，抗氧化活性是以抗氧化劑抑制藍綠色的ABTS自由基的產生來評價的。

圖7 沙棘果油和VC對ABTS的清除率Fig.7 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on ABTS free radical

由圖7可知，在選擇的濃度范圍內，ABTS自由基清除率與濃度呈良好的線性關系，在濃度范圍為2～20 mg/mL時，沙棘果油的ABTS自由基清除能力由9.50%增加到73.20%，而VC對ABTS自由基的清除能力在同樣的濃度范圍內基本保持不變，維持在100%左右。在DPPH自由基清除試驗中，VC的IC50值為0.98 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為11.22 mg/mL，是VC的0.09倍，此時所需的沙棘原漿為1020 mg。

2.3.3 沙棘果油對羥自由基的清除能力

羥自由基是一種廣泛存在于生物體內的高細胞毒性自由基，它能引起胞內蛋白質、核酸等物質的損傷，導致各種疾病和機體衰老現象，反應速度很快。

圖8 沙棘果油和VC對·OH的清除率Fig.8 The scavenging rates of sea buckthorn fruit oil and VC on·OH free radical

由圖8可知，在選擇的濃度范圍內，沙棘果油和VC對羥自由基的清除能力幾乎呈線性上升，顯現量效關系。在DPPH自由基清除試驗中，VC的IC50值為10.12 mg/mL，而沙棘果油的IC50值為19.05 mg/mL，是VC的0.53倍，此時所需的沙棘原漿為1731 mg。

正常情況下，體內活性氧化物處于動態平衡狀態，它的產生和消失有一定運作機制。一但某些原因打破這種動態平衡狀態，導致體內氧化物增多或機體清除氧化物能力下降，機體就會產生應激現象。當機體不能及時有效地調節這種狀態時，活性氧化物的含量就會相對增加，對機體產生危害。為了機體免受細胞氧化物的損害，可以合理使用抗氧化劑和自由基清除劑保護機體。本文研究表明，沙棘果油能夠有效清除DPPH、ABTS以及羥自由基等活性氧化物，可以作為一種抗氧化劑。

3 結論

在本研究中，提取沙棘果油較為理想的有機溶劑為石油醚。以單因素試驗為基礎，采用正交試驗優化沙棘果油的提取工藝，結果顯示：對提取率有影響的4個因素中，影響最大的為提取時間，最小的為提取溫度，其影響順序為提取時間>提取次數>料液比>提取溫度。正交試驗優化的結果為提取溫度55 ℃、提取時間25 min、料液比1∶4、提取次數2次。體外抗氧化試驗表明，沙棘果油對DPPH、ABTS和羥自由基的IC50值分別為4.47，11.22，19.05 mg/mL，分別是VC清除DPPH、ABTS和羥自由基的0.22，0.09，0.53倍，此時所需的沙棘原漿分別為406.36，1020，1731 mg。