葡甘聚糖酶制備魔芋葡甘露低聚糖的工藝研究

仝澤方，李利軍，盧美歡，馬英輝，吳文朋

(陜西省微生物研究所，西安 710043)

魔芋是天南星科魔芋屬多年生草本植物，魔芋葡甘聚糖是其主要活性成分[1]。魔芋葡甘聚糖為水溶性膳食纖維，有輔助醫療和保健作用，是一種優良的食品添加劑[2]。然而，由于其分子量大，具有遇水后高膨脹、高黏度的特性，過量攝入將引起抗營養作用，從而使其應用受到限制[3]。葡甘聚糖酶可以將魔芋精粉中的葡甘露聚糖分解為2～10個單糖單位，并以β-1,4或β-1,3糖苷鍵連接，生成具有直鏈或支鏈的魔芋葡甘露低聚糖[4-5]。有研究表明，魔芋葡甘露低聚糖除了具有低熱量、穩定和安全無毒等良好的理化性質外[6]，對以雙歧桿菌為代表的有益菌群也有明顯的促生長作用，不但可以改善腸道內菌群結構，還能夠增強機體免疫力。有試驗證明，魔芋葡甘露低聚糖還有明顯的降脂作用，可以作為高血脂糖尿病的輔助治療產品[7-8]。同時，葡甘露低聚糖還具有清除自由基，吸附病原菌和抑制腸內氨的形成和吸收等良好的作用[9]。魔芋葡甘露低聚糖因其諸多優良的理化性質分別在食品工業領域、生物醫學領域、功能材料領域應用廣泛。

尤其是在食品工業中，魔芋葡甘露低聚糖不僅可以用于保健食品和食品添加劑，也可作為原材料制成食品保鮮膜[10-11]。文本主要利用酶法生產葡甘露低聚糖，研究了不同因素對其制備低聚糖工藝的影響，并對其工藝條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料

葡甘聚糖酶：自制；魔芋精粉：陜西錦泰魔芋產業發展有限公司；DNS試劑：配制。

1.2 儀器及設備

722型分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海大普儀器有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；電子萬用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；JM-B 10002電子天平 余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司。

1.3 葡甘聚糖酶的制備

黑曲霉3758由陜西省微生物研究所菌種資源中心選育和保藏，經過篩選馴化選育出葡甘聚糖酶產量高的黑曲霉菌株。利用麩皮、豆粕、魔芋膠以及少量無機鹽組成的固體培養基，接種該黑曲霉菌株在30 ℃發酵72 h，然后經浸泡提取獲得葡甘聚糖酶粗酶液，酶活力可達到6000 U/mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 酶活力測定

以5.0 g/L魔芋膠為底物溶液。加入適量葡甘聚糖酶，在pH 5.5、50 ℃恒溫水浴鍋中反應15 min；采用DNS法測定酶解液中還原糖的量。在上述條件下，以每1 min酶解底物產生1 μmol還原糖(以甘露糖計)的酶量定義為1個β-甘露聚糖酶活力單位(U)[12]。

1.4.2 葡甘露低聚糖的制備

配制一定量的pH為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，置于250 mL的錐形瓶中，加入一定量的魔芋粉溶液和葡甘聚糖酶，于恒溫搖床中以200 r/min反應一定時間后，測定酶解液中的甘露糖含量。

1.4.3 單因素試驗

按照葡甘露低聚糖的制備方法，以還原糖得率為考察指標，依次進行12個魔芋粉濃度5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90 g/L；12個酶添加量36.14，50.04，61.16，75.06，86.18，100.08，113.98，125.1，136.22，150.12，161.24，175.14 U/g；9個pH值1，2，3，4，5，6，7，8，9；15個反應溫度25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 ℃；9個反應時間1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，8.00，10.00，24.00 h的單因素試驗。每個水平重復3次，測定結果取平均值。

1.4.4 正交試驗

依據單因素試驗結果，以還原糖得率為考察目標，選擇魔芋粉濃度、酶添加量和反應時間，設計三因素三水平正交試驗L9(34)，并重復3次，結果取平均值，最后通過極差分析和單因素試驗結果確定葡甘露低聚糖制備的最佳工藝。

2 結果與討論

2.1 魔芋膠酶解條件單因素試驗

2.1.1 酶添加量的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、反應時間為2 h、魔芋膠濃度為10 g/L的條件下探究酶添加量對還原糖轉化率的影響，結果見圖1。

圖1 酶添加量對還原糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme additive amount on the yield of reducing sugar

由圖1可知，隨著酶添加量的逐漸增多，還原糖轉化率也在提升，但當酶的添加量大于150 U/g之后，還原糖轉化率趨于平穩，不再有明顯的提升。因此，在保證產物中葡甘露低聚糖含量的前提下，要盡量減少葡萄糖和甘露糖等單糖的量，就需控制魔芋膠的酶解程度。

2.1.2 底物魔芋粉濃度的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、反應時間為2 h、酶添加量為61.16 U/g的條件下探究底物濃度對還原糖轉化率的影響，結果見圖2。

圖2 底物濃度對還原糖得率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the yield of reducing sugar

由圖2可知，隨著底物濃度的逐漸增加，還原糖轉化率逐漸升高，但變化趨勢并不顯著。可以推測隨著魔芋膠濃度的增加，底物粘度增大，可能會影響酶解反應的繼續進行。因此選擇底物濃度為10～30 g/L。

2.1.3 酶解pH的影響

在溫度為40 ℃、反應時間為2 h、酶添加量為61.16 U/g、底物濃度為10 g/L的條件下探究酶解pH對還原糖轉化率的影響，結果見圖3。

圖3 pH對還原糖得率的影響Fig.3 Effect of pH value on the yield of reducing sugar

由圖3可知，當pH值小于4時，隨著pH值的增大，還原糖轉化率逐步提升，在pH為4時最大。但是當pH在4～9區間時，還原糖轉化率一直是下降的趨勢。這是由于葡甘聚糖酶的最適pH可能為4左右，pH大于4時減弱了葡甘聚糖酶的活性，導致酶解反應速度減慢，還原糖轉化率的降低。

2.1.4 酶解溫度的影響

在pH為5.8、反應時間為2 h、底物濃度為10 g/L，酶添加量為61.16 U/g的條件下探究酶解溫度對還原糖轉化率的影響，結果見圖4。

圖4 溫度對還原糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of reducing sugar

由圖4可知，在25～75 ℃之間，隨著溫度的升高，還原糖轉化率整體呈現上升趨勢，并在75 ℃時達到最高。而當溫度一旦高于75 ℃時，還原糖轉化率呈下降趨勢。這可能是由于溫度過高破壞了酶的蛋白質結構，導致了部分變性，故而影響了酶與底物的反應，導致還原糖轉化率降低。

2.1.5 酶解時間的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、底物濃度為10 g/L、酶添加量為61.16 U/g的條件下探究酶解時間對還原糖轉化率的影響，結果見圖5。

由圖5可知，在1～4 h內，還原糖轉化率隨著反應時間的延長而逐漸增加；在4～10 h內，還原糖轉化率的變化并不明顯，趨于平穩；在10 h之后，還原糖轉化率又呈下降趨勢。因此，對于酶解反應存在著最佳反應時間，反應時間一旦過長，有可能造成低聚糖進一步水解為單糖，導致還原糖轉化率降低。

圖5 時間對還原糖得率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of reducing sugar

2.2 魔芋膠酶解條件正交試驗

選擇酶添加量、魔芋膠濃度、酶解時間3個因素，利用正交試驗表L9(34)進行三因素三水平正交試驗，見表1。

表1 正交試驗結果與分析Table 1 Orthogonal experiment results and analysis

由表1可知,極差RA>RB>RC，因此影響因素底物濃度>酶添加量>酶解時間。最佳條件為A1B3C2，即酶解最佳條件為：酶添加量80 U/g，底物濃度10 g/L，酶解時間4 h。而之后所做的酶解最佳條件的驗證試驗也證明了這一點，在上述條件下，還原糖轉化率為93.21%。

2.3 討論

通過單因素試驗發現酶添加量、底物濃度、pH值、反應時間和溫度對還原糖轉化率的影響并不只是線性關系。在此基礎上進行的正交試驗表明其中影響程度最大的是底物濃度，影響最小的是反應時間，并且進一步篩選出酶解最佳條件：pH 5.8，反應溫度75 ℃，底物濃度10 g/L，酶添加量80 U/g，反應時間4 h。經過酶解最佳條件的驗證試驗，還原糖轉化率可達93.21%。

有文獻表明，酸解法和超聲波法分解魔芋葡甘聚糖時所用物質酸度過高，造成的環境污染嚴重，且產物分子量不易控制，相較于酶解法效果不佳[13]。按照上述酶解法來分解魔芋葡甘聚糖是目前實驗室獲取魔芋葡甘低聚糖的主要方法，李劍芳等利用黑曲霉菌株LW-1所產酸性β-甘露聚糖酶制備魔芋葡甘露低聚糖，該酶制備葡甘露低聚糖的工藝條件為：魔芋膠濃度150 g/L，加酶量50 U/g，50 ℃水解6 h，在上述條件下，酶解產物主要是2～10個單糖單位的葡甘露低聚糖。許牡丹等利用黑曲霉β-甘露聚糖酶探究了制備葡甘露低聚糖的最佳工藝條件，魔芋粉濃度2.0%，加酶量108 U/g，反應溫度65 ℃，pH 4.2，反應時間4.0 h，葡甘露低聚糖產率可達32.3%，并且本試驗方法中還原糖得率也能達到93.21%，相對于其他工藝有明顯優勢。但對于工業生產來說，固定化酶能顯著縮短水解時間，降低生產成本，并能實現連續化生產[14]，所以固定化酶解工藝還需進一步研究。

近年來，針對魔芋葡甘露低聚糖的研究已逐漸增多，并且其理化特性也在諸多領域應用廣泛，尤其是在食品工業方面。魔芋葡甘露低聚糖的增稠性能使其常用于肉制品和淀粉制品中提升產品的感官和質地，而合理利用魔芋葡甘露低聚糖的流變性能可以提升產品的質地和口感，并且其良好的成膜性可用于果蔬涂膜保鮮方面和生物醫藥領域。但魔芋葡甘露低聚糖在食品、飲料、營養補充劑，生物醫學和功能材料方面還需要進一步的深入研究，并且也具有廣闊的應用前景。