植物乳桿菌素plantaricinQ7在牛乳貯藏保鮮中的應用

步雨珊　李劍勛　易華西　劉同杰　公丕民　王淑梅　劉銀雪

摘? 要： 植物乳桿菌素plantaricin Q7是由植物乳桿菌Lactobacillus plantarum Q7產生的，其具有廣譜抑菌活性的細菌素，有安全、高效、穩定性好等優點.將效價為533 AU?mL^-1的植物乳桿菌素Q7添加到牛乳中，探究其在牛乳貯藏過程中的保鮮效果.結果表明：植物乳桿菌素Q7維持了牛乳良好感官，牛乳貯藏第13天時仍沒有異味出現，保持乳白色、略帶黃色的狀態，無分層和沉淀.熒光假單胞菌是牛乳中的優勢嗜冷腐敗菌.未添加植物乳桿菌素Q7的牛乳中，熒光假單胞菌落數在第7天超出國標規定;添加植物乳桿菌素Q7將延長熒光假單胞菌落數超出國標規定的時間4 d.植物乳桿菌素Q7有效減緩了牛乳酸度的增加速度，降低了牛乳pH值的下降速度.本研究為植物乳桿菌素Q7的開發與應用提供了依據.

關鍵詞： 植物乳桿菌素; 牛乳; 貯藏; 保鮮

中圖分類號： TS 252.4??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2021）02-0146-08

Application of plantaricin Q7 in the storage and preservation of milk

BU Yushan¹， LI Jianxun¹， LIU Yinxue¹， LIU Tongjie¹， GONG Pimin¹，WANG Shumei^2*， YI Huaxi^1*

（1.College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266000， Shandong， China;2.College of Food Engineering， Harbin University， Harbin 150086， Heilongjiang， China）

Abstract： Plantaricin Q7 is a bacteriocin produced byLactobacillus plantarumQ7 with broad-spectrum antibacterial activity.It has the advantages of safety，high efficiency and good stability.In this study，plantaricin Q7 with a titer of 533 AU?mL^-1was added to milk to explore its preservation effects in the process of milk storage.The result showed that plantaricin Q7 maintained the good sense of milk.There was no peculiar smell on the 13^thday of storage，and the milk remained white and slightly yellow，without stratification and precipitation.Pseudomonas fluorescenswas the dominant psychrophilic spoilage bacteria in milk.Without adding plantaricin Q7，the number ofP.fluorescensin milk exceeded the national standard on the 7^thday.After adding plantaricin Q7，the time ofP. fluorescensexceeding the national standard was postponed for 4 days.Plantaricin Q7 effectively slowed down the increase of milk acidity and the decrease of milk pH value.The results provided a basis for the development and application of plantaricin Q7.

Key words： plantaricin; milk; storage; preservation

0? 引言

牛乳中含有乳糖、優質蛋白、必需氨基酸、脂溶性維生素、礦物質等，其營養價值豐富且易于吸收，對維持人體健康有著重要作用^[1].然而正是由于牛乳高營養的特點，在生產、運輸及保藏過程中，微生物容易在其中加速繁殖，從而導致牛乳品質下降^[2].為了保證牛乳貯藏過程中的安全性和營養價值，尋找一種方便、安全、有效的防腐策略十分必要.低溫保藏是最常見的一種措施，但低溫無法抑制嗜冷菌生長，特別是牛乳中的優勢腐敗菌——熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在低溫時仍可以存活^[3]，其產生的蛋白酶及脂肪酶能夠耐受高溫，即使高溫滅菌也無法將其滅活^[4].使用防腐劑是食品保鮮的另一項重要策略，其中綠色健康的生物防腐劑認可度更高^[5].細菌素是細菌代謝產生的能夠發揮抑菌功效的多肽或蛋白質，是目前食品生物防腐領域的研究熱點，乳酸鏈球菌素Nisin應用廣泛^[6].GAO等^[7]探究了清酒乳桿菌C2（Lactobacillus sakeiC2）產生的細菌素sakacin C2對低脂和全脂牛乳中大腸桿菌（Escherichia coli）活性的影響，發現Nisin能夠增強sakcin C2的抑菌功效.JIN^[8]開發抗菌涂料時發現，在未經聚乳酸和乳酸鏈球菌素Nisin混合物處理的脫脂牛乳中，單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）生長良好，涂抹聚乳酸和250 mg Nisin后，在3～42 d的整個儲存期內完全滅活了脫脂牛乳中的單增李斯特菌，產生了較好的抗菌防腐效果.Nisin雖然安全高效，但只能抑制革蘭氏陽性菌生長，卻不能殺滅牛乳中熒光假單胞菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌^[9].本課題組前期從青海牦牛奶中篩選到一株具有抑菌特性的植物乳桿菌Lactobacillus plantarumQ7，完成了全基因組測序，經分離純化和結構鑒定，確定其抗菌成分是植物乳桿菌素Q7^[10].植物乳桿菌素Q7屬于Ⅱ類細菌素，不僅無毒、高效、穩定性強，而且抑菌譜廣，對多種革蘭氏陽性和陰性菌（單增李斯特菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、志賀氏菌等）均具有明顯的抑制效果，可以作為生物防腐劑在牛乳貯藏保鮮中發揮作用.

1? 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌? 株

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumQ7保存于中國海洋大學食品科學與工程學院功能性乳品與益生菌工程研究室.

熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens CICC23253購自中國工業微生物菌種保藏管理中心.

1.1.2 儀? 器

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、SW-CJ-1D潔凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）、LRH-250生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、ZWY-1102C雙層恒溫培養振蕩器（上海智城分析制造有限公司）、TG20KR-D高速冷凍離心機（長沙東旺實驗儀器有限公司）、PB-10pH計（賽多利斯儀器有限公司）.

1.1.3 試? 劑

MRS肉湯（青島海博生物技術有限公司）、LB肉湯（青島海博生物技術有限公司）、LB營養瓊脂（青島海博生物技術有限公司）、酚酞（國藥集團化學試劑有限公司）、氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）、蒸餾水.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化

植物乳桿菌Q7以2%（體積分數）的比例接種到MRS肉湯中，在37 ℃培養箱內培養24 h活化;熒光假單胞菌以2%（體積分數）的比例接種到LB肉湯中，在25 ℃振蕩培養箱內培養24 h活化，兩者均活化兩代之后進行實驗.

1.2.2 植物乳桿菌素Q7制備

將植物乳桿菌Q7發酵液以8 000 r?min^-1的速度離心5 min，除去菌體，獲取上清液.用氫氧化鈉將上清液調至與蒸餾水pH值一致，然后經0.22 ?m濾膜過濾后進行超濾濃縮處理備用.

1.2.3 牛乳預處理

將牛乳分裝完成后在95 ℃恒溫水浴鍋內滅菌10 min，待其冷卻后接入熒光假單胞菌，使菌液在牛乳中的終濃度為1×10³CFU?mL^-1.實驗組牛乳中加入濃縮的植物乳桿菌素Q7，使其在牛乳中的終效價為533 AU?mL^-1;對照組加入等量蒸餾水.將處理好的牛乳密封好，儲存于4 ℃的冰箱中，每隔1 d取樣進行感官、熒光假單胞菌落數、酸度和pH值檢測.

1.2.4 牛乳感官評價

由8位培訓后的食品專業學生組成感官評價小組，每隔1 d從氣味、色澤和組織狀態3方面對牛乳評分，評分表制定參照GB 19301—2010^[11]，如表1所示.

1.2.5 牛乳中熒光假單胞菌落數測定

牛乳中熒光假單胞菌落數測定參照GB 4789.2—2016^[12].每隔1 d取牛乳，使用生理鹽水做10倍梯度稀釋，在合適的梯度下取100 ?L牛乳稀釋液進行涂布，在25 ℃下培養48 h后計數.

1.2.6 牛乳酸度測定

牛乳酸度測定參照GB 5009.239—2016^[13].每隔1 d用酚酞作為指示劑，采用滴定法測定牛乳酸度.

1.2.7 牛乳pH值測定

每隔1 d用pH計測定牛乳的pH值.

1.2.8 統計學方法

實驗設置3次重復，結果以平均值±標準差表示.

2? 結果與討論

2.1 植物乳桿菌素Q7對牛乳感官特性的影響

2.1.1 植物乳桿菌素Q7對牛乳氣味的影響

從圖1可以看出，對照組牛乳儲存前7天一直有奶香味，沒有異味出現，然而從第9天開始出現異味，卻仍可以接受，但在第13天時腐敗味道較濃，有刺鼻氣味.添加植物乳桿菌素Q7后，實驗組牛乳儲存前7天奶香氣濃郁，直到第13天仍沒有異味出現，說明植物乳桿菌素Q7對腐敗菌生長有一定抑制作用，減緩了細菌將牛乳中乳糖和蛋白類物質分解而產生腐敗氣味，使牛乳保持香氣.

2.1.2 植物乳桿菌素Q7對牛乳色澤的影響

植物乳桿菌素Q7對牛乳色澤的影響如圖2所示.對照組牛乳從第9天起色澤變暗，逐漸出現焦黃色，第13天時牛乳顏色發青，在視覺上不可接受.而實驗組牛乳在第13天還保持乳白色、略帶黃色的狀態，說明植物乳桿菌素Q7抑制了熒光假單胞菌的生長，使蛋白酶將牛乳蛋白分解為氨基酸引起褐變的過程得到緩解，從而使牛乳維持乳白色、略帶黃色.

2.1.3 植物乳桿菌素Q7對牛乳組織狀態的影響

對儲存13 d內牛乳的組織狀態進行評價，結果如圖3所示.對照組牛乳在前3天時組織狀態良好，到第7天時均一性略有下降，第11天時有分層現象，第13天在底部已有絮狀沉淀.添加了植物乳桿菌素Q7的牛乳在儲存前9天保持均勻一致，沒有凝塊沉淀出現，第13天雖然稍有黏稠，但并沒有出現分層、沉淀等.熒光假單胞菌蛋白酶會將牛乳中的酪蛋白分解，使蛋白質失去平衡從而形成沉淀^[14]，植物乳桿菌素 Q7的添加一定程度上抑制以上過程的發生，使牛乳保持良好的組織狀態.

2.1.4 植物乳桿菌素Q7對牛乳感官的綜合影響

根據牛乳的氣味、色澤和組織狀態，對牛乳的感官進行綜合打分，結果如圖4所示.比較每天的分值，發現對照組總低于添加植物乳桿菌素Q7組.13 d內添加植物乳桿菌素Q7的牛乳感官總分不低于20分，而未添加細菌素的牛乳從第9天起便低于20分，第13天總分只有8.45分.通過感官評價發現：植物乳桿菌素Q7有助于牛乳在貯藏保鮮過程中維持良好感官.

2.2 植物乳桿菌素Q7對牛乳中熒光假單胞菌落數的影響

GB 19301—2010規定菌落總數低于2×10⁶CFU?mL^-1的牛乳符合標準^[11].在實驗初始，向牛乳中添加1×10³CFU?mL^-1的熒光假單胞菌.由圖5可知：對照組牛乳在儲存1 d后熒光假單胞菌落數便超出1×10³CFU?mL^-1，并且菌落數以較快的速度增加，第7天時超過2×10⁶CFU?mL^-1，在第13 d已高達10⁹CFU?mL^-1左右.添加了植物乳桿菌素Q7的牛乳在儲存第1天和第3天時，由于細菌素對熒光假單胞菌生長有抑制作用，菌落數均低于起始的1×10³CFU?mL^-1.從第5天起，菌落數開始超過起始接入的熒光假單胞菌數，直到第9天仍低于2×10⁶CFU?mL^-1，到第11天時，菌數超過國標規定，但超出范圍很小.植物乳桿菌素Q7的添加，使牛乳中熒光假單胞菌的增長速度變慢，除了從第5天到第7天增長速度較快，其余時間菌落數都以較慢的速度增長.從牛乳中熒光假單胞菌落數的變化可以看出：植物乳桿菌素Q7有效地抑制了牛乳中熒光假單胞菌的生長，對牛乳貯藏起到較好的保鮮效果.

2.3 植物乳桿菌素Q7對牛乳酸度的影響

GB 19301—2010規定牛乳酸度為12～18 °T^[11].添加植物乳桿菌素Q7后，牛乳酸度變化如圖6所示.隨著儲存天數的增多，細菌不斷繁殖從而產酸，使得牛乳的酸度不斷增加.13天內添加植物乳桿菌素Q7牛乳的酸度始終低于對照組牛乳的酸度.對照組牛乳的酸度在第5天就已超出國標范圍，在第13天時達到35 °T;而添加植物乳桿菌素Q7后，實驗組在第9天酸度才超過18 °T，最終達到25 °T.可見植物乳桿菌素Q7可以減慢牛乳酸度的增加，在牛乳貯藏過程中起到保鮮作用.

2.4 植物乳桿菌素Q7對牛乳pH值的影響

植物乳桿菌素Q7對牛乳pH值的影響如圖7所示.隨著儲存天數的延長，牛乳的pH值不斷下降.對照組牛乳的pH值從第1天的6.66下降到5.67，而添加植物乳桿菌素Q7后，牛乳的pH值從6.67下降至6.26，雖然pH值依然呈現下降趨勢，但是速率明顯減慢.這說明植物乳桿菌素Q7可以控制細菌生長，從而抑制產酸，阻止牛乳pH值的快速下降，在牛乳貯藏保鮮中發揮重要作用.

3? 結論

本文探究了植物乳桿菌素Q7在牛乳貯藏過程中的保鮮效果.通過對貯藏13 d的牛乳進行氣味、色澤和組織狀態等感官評價，以及對牛乳中熒光假單胞菌落數、酸度和pH值進行測定，發現添加植物乳桿菌素Q7能保持牛乳的感官品質，抑制牛乳中腐敗菌生長，有助于牛乳維持正常酸度和pH值，表明植物乳桿菌素Q7在乳品工業中的應用潛力，為植物乳桿菌素Q7在食品防腐保鮮中的應用提供了依據.

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（責任編輯：顧浩然，馮珍珍）