舒洛地特調控miR-27a介導自噬調控糖尿病腎病足細胞損傷機制研究

徐靜琳　孔祥靜　　韓穎敏　　陶海英

[關鍵詞] 舒洛地特;微小RNA-27a;自噬;糖尿病腎病;足細胞損傷

[中圖分類號] R285.5;R587.205? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）14-0039-06

Mechanism research of sulodexide in regulating miR-27a-mediated autophagy in regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy

XU Jinglin1? ?KONG Xiangjing1? ?HAN Yingmin1? ?TAO Haiying2

1.Department of Nephrology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou? ?318000， China; 2.Department of Endocrinology， the First People′s Hospital of Taizhou City in Zhejiang Province， Taizhou 318000， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of sulodexide in regulating microRNA-27a（miR-27a）-mediated autophagy in the regulation of podocyte injury in diabetic nephropathy. Methods Fifteen of the 45 rats were selected as the normal group without any treatment， and the remaining rats were used to establish a diabetic nephropathy rat model and randomly divided into the model group and the sulodexide group with 15 rats in each group. Rats in the sulodexide group were given intramuscular injection of sulodexide， while those in the normal group and the model group were given intramuscular injection of equal volume of normal saline. Histopathological changes， blood glucose， blood lipid and renal function indexes， podocyte autophagosome status， apoptosis rates， and podocyte specific protein expression levels， including Nephrin， Desmin， GPR124， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein were observed. Results The blood glucose， lipid and renal function indexes， podocyte apoptosis rates， Desmin， miR-27a and AMPK-mtor signaling pathway protein expression levels in the sulodexide group were lower than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. The number of podocyte autophagosomes， the protein expression of Nephrin and GPR124 in the sulodexide group were higher than those in the model group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Sulodexide can mediate the reduction of the expression of AMPK， mTOR and Bax proteins by decreasing miR-27a， and then inhibit the AMPK-mTOR signaling pathway， promote autophagy， inhibit apoptosis and reduce the injury of podocytes in diabetic nephropathy.

[Key words] Sulodexide; miR-27a; Autophagy; Diabetic nephropathy; Podocyte injury

隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病及其并發癥的發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響人們的生活質量，其中糖尿病腎病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，目前已成為導致終末期腎病（End-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一[1-2]。有數據顯示[3]，我國DKD的患病率為20%～40%，此病起病較為隱匿，一旦進入大量蛋白尿期后，進展至ESRD的速度顯著加快，因此，早期診斷、預防與延緩DKD的發生發展對提高DKD患者存活率、改善其生活質量具有重要意義。有研究顯示[4]，微小RNA-27a（microRNA-27a，miR-27a）在DKD患者體內呈異常高表達，可刺激系膜細胞外基質合成增加即降解減少，加重DKD進展。目前臨床研究證實[5]，舒洛地特是從動物小腸分離提取沉淀而成的一種天然血管壁糖胺聚糖，具有較高的血管趨向性且對糖尿病尿蛋白的發生具有防治作用。但miR-27a在DKD中的調控機制尚未十分清楚，故本研究旨在探討舒洛地特調控miR-27a介導自噬調控糖尿病腎病足細胞損傷機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取45只雄性SPF級大鼠，購自冠科生物技術（中山）有限公司，動物許可證號：SYXK（粵）2020-0240，平均體重（218.63±32.45）g，在相對濕度為30%～35%、平均溫度（23.8±1.5）℃下飼養1周，每日光照24 h。本實驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關規定進行，且獲得我院醫學倫理委員會審批同意。

1.2方法

1.2.1 儀器及試劑? 血糖儀、血糖試紙購自上海信帆生物科技有限公司;普通光學顯微鏡購自上海普赫光電科技有限公司;鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自上海恪敏生物科技有限公司;AMPK抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司;mTOR抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司;Bax抗體購自上海振譽生物科技有限公司。

1.2.2 分組及建模? 選取45只中15只大鼠作為正常組不做任何處理，其余大鼠均參照鄧文榮等[6]研究建立糖尿病腎病大鼠模型，隨機分為模型組、舒洛地特組各15只，大鼠均使用高糖高脂的飼料喂養2周后腹腔注射50 mg/kg避光溶解于pH=4.28檸檬酸鈉緩沖液的STZ溶液，注射7 d后取大鼠尾部靜脈血進行空腹血糖監測并收集尿液監測尿肌酐、尿微量白蛋白，建模成功標準：血糖水平≥16.7 mmol/L及尿肌酐、尿微量白蛋白顯著高于正常組;此外，正常組常規飼養。

1.2.3 給藥方法? 舒洛地特組大鼠給予10 mg/（kg·d）舒洛地特肌內注射，正常組和模型組給予等體積生理鹽水肌內注射。

1.3 觀察指標

1.3.1 病理組織學觀察? 在大鼠建模成功后12周，采用2%戊巴比妥鈉對大鼠麻醉后暴露其心臟，采用快速針刺入心尖部采血;隨后頸椎脫臼法處死小鼠并迅速解剖摘取其腎臟，將腎臟縱向對半切開并去除筋膜，取1/4腎組織固定于使用冷生理鹽水漂洗后去除血液，使用濾紙吸干。采用10%福爾馬林固定后，將固定液倒出并用水沖洗浸泡1 d，換水1 h/次，將組織修出平整的切面，使用乙醇進行分級梯度脫水，將標本置于二甲苯溶液中并擰緊蓋子，更換二甲苯40 min/次，進行透明處理，將標本置于58℃箱內，90 min/次，重復2次，進行透臘處理，將其常規切片、封片后，在光學顯微鏡下觀察病理學變化。

1.3.2 血糖、血脂和腎功能指標評價? 采用上海帝博思生物科技有限公司的PUZS-300全自動生化分析儀檢測血糖（Blood sugar，BG）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、24 h尿白蛋白排泄量（Urinary albumin excretion，UAE）。

1.3.3 足細胞自噬體情況、凋亡率評價? 采用上海經科化學科技有限公司的透射電鏡觀察足細胞自噬體情況;采用默瑞（上海）生物科技有限公司的DxFLEX流式細胞儀檢測足細胞凋亡率

1.3.4 足細胞特異性蛋白腎病蛋白（Nephrotic protein，Nephrin）、結蛋白（Desmin）、G-蛋白偶聯受體124（G protein-coupled receptor 124，GPR124）評價? 采用RT-PCR法檢測Nephrin、Desmin、GPR124表達，實驗步驟：將1 mL TRNzol加入癌組織、癌旁組織取總DNA并檢測其純度和濃度，提取2 μg總DNA并加入內參GAPDH及目的小分子RNA Nephrin、Desmin、GPR124逆轉錄引物，42℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉錄合成cDNA;PCR反應條件：95℃ 預變性10 min，95℃、60℃、95℃、60℃、95℃時間分別12 s、40 s、15 s、30 s、15 s（收集熒光），40個循環，使用Primer5.0軟件對引物序列進行設計，Nephrin引物序列上游：5'-CCTGTGAAACCTCGGGAATA-3'，下游：5'-GACCGAGTCAGGAACGAATA-3';Desmin引物序列上游：5'-TGAAGAGGAGATCCGTGAG-3'，下游：5'-AGTGAGGTCTGGCTTAGA-3';GPR124引物序列上游：5'-ATGGAGCTGAGCGCCTTTCCC-3'，下游：5'-TCCAACCCAAGGTCAGGCCCAT-3';內參GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.3.5 miR-27a、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路蛋白表達量評價? 采用Western blot法檢測腎臟組織miR-27a、AMPK-mTOR信號通路蛋白表達量，實驗步驟：將腎臟組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進行處理，將采集到的樣本研磨加入蛋白緩沖液，提取細胞蛋白并使用BCA法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進行SDS-PAGE電泳，蛋白轉至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶1000）4℃ 孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗（1∶4000）室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入發光液曝光3～4次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白為GAPDH。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件進行分析處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠病理組織學觀察

正常組腎組織形態未見明顯異常，腎間質、腎小球和腎小管的結構基本正常;模型組腎組織可見腎小球毛細血管袢肥大、系膜基質增多、腎小囊腔狹窄及腎小管出現管腔擴張、纖維化或萎縮，出現水腫和炎癥細胞浸潤，且可見空泡樣變性，上皮細胞出現變形、脫落和部分壞死;舒洛地特組腎臟病理損傷較模型組可見有所減輕。

2.2 各組大鼠血糖、血脂和腎功能指標比較

舒洛地特組、模型組血糖、血脂和腎功能指標均高于正常組， 差異有統計學意義（P<0.05）;舒洛地特組血糖、血脂和腎功能指標均低于模型組， 差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 各組大鼠足細胞自噬體情況、凋亡率比較

正常組大鼠足細胞足突正常、線粒體和內質網結構正常;模型組大鼠足突明顯增寬、融合，基底膜明顯增厚，足細胞內質網損傷明顯且呈空泡樣變;舒洛地特組較模型組足突融合及基底膜增厚明顯減輕，足細胞內質網損傷有所減輕。見圖1～2。舒洛地特組、模型組足細胞自噬體數量少于正常組，凋亡率高于正常組，，差異有統計學意義（P<0.05）;舒洛地特組足細胞自噬體數量多于模型組，凋亡率低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠足細胞特異性蛋白Nephrin、Desmin、GPR124蛋白表達量比較

舒洛地特組、模型組Desmin蛋白表達量高于正常組，Nephrin、GPR124蛋白表達量低于正常組， 差異有統計學意義（P<0.05）;舒洛地特組Desmin蛋白表達量低于模型組，Nephrin、GPR124蛋白表達量高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5 各組大鼠miR-27a、AMPK-mTOR信號通路蛋白表達量比較

舒洛地特組、模型組miR-27a、AMPK-mTOR信號通路蛋白表達量均高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）;舒洛地特組miR-27a、AMPK-mTOR信號通路蛋白表達量均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

DKD的病理發病機制復雜，受腎臟血流動力學異常、血糖值高導致的代謝變化、高血壓及血管活性物質代謝異樣及遺傳因素等影響，目前臨床上治療DKD的藥物存在療效長、副作用多及費用昂貴等劣勢，進一步探索DKD的發病機制，找尋安全有效治療策略一直是糖尿病領域的熱點話題[7-8]。有研究顯示[9-10]，舒洛地特在DKD治療中具有減少蛋白尿的腎臟保護作用，還具有抗凝、抗栓、保護血管內皮等作用，其作用機制可能為舒洛地特可補充DKD患者丟失的陰離子成分糖胺聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs）、修補腎小球基底膜結構并恢復電荷屏障以減少尿蛋白丟失，降低DKD患者的尿蛋白水平。miRNA在人類的多種疾病中均可發揮調控作用，其在糖尿病腎病中亦具有重要作用，miR-27a-3p在DKD患者體內呈異常高表達，高表達miR-27a-3p對腎纖維化具有促進作用[11]。本研究結果顯示，舒洛地特可下調miR-27a表達，對腎纖維化起一定的保護作用，為DKD的治療奠定基礎。

DKD的病理改變包括腎小球細胞外基質積累及基底膜增厚，但特征性標志為蛋白尿，但越來越多研究發現[12]，足細胞參與DKD蛋白尿的發生，是DKD發病與進展的中心靶點。足細胞是終末分化的細胞，其再生能力有限，在糖尿病等應激因素的作用下，大量的蛋白和細胞器積聚在足細胞內并產生毒性作用，若未得到有效清除將會誘發細胞凋亡或死亡，進而引起足細胞損傷和功能失調等不可逆性變化并導致足細胞缺失[13-14]。在正常情況下，足細胞有著較高的自噬活性可清除受損的蛋白和細胞器，從而免受損傷。本研究結果顯示，DKD患者體內足細胞存在一定損傷，舒洛地特可通過下調miR-27a介導自噬，緩解DKD足細胞損傷，延緩疾病進展。

臨床上將Nephrin視為腎小球足細胞損傷的重要標志物，其是構建足細胞裂空隔膜的關鍵蛋白且特異性地在腎小球足細胞中表達，在高糖等應激條件下易導致Nephrin表達減少，從而導致裂空隔膜破壞和大量蛋白尿[15]。在吳欣等[16]研究中，Desmin是一種細胞骨架中間絲蛋白，在正常情況下僅在系膜細胞中少量表達，但當足細胞受損時，其表達顯著增加，故可作為足細胞損傷的標志蛋白。GPR124為G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPR）家族中的孤兒受體，其在DKD患者體內呈低表達，上調其表達可增強細胞的自噬功能、減少細胞凋亡，發揮對足細胞功能的保護作用[17]。本研究結果顯示，足細胞內可通過下調miR-27a促進Desmin蛋白表達量下調，Nephrin、GPR124蛋白表達量上調，進而緩解足細胞損傷，對足細胞發揮一定保護作用。

臨床研究證實[18-19]，AMPK-mTOR信號通路表達異常在DKD足細胞損傷中起著重要作用，可通過對此信號通路進行調節，進而激活足細胞自噬、改善足細胞損傷，起到抗DKD的作用。AMPK是一種重要的受體且是自噬的主要調節劑，活化的AMPK對mTOR具有負調節作用，在富含氨基酸和生長因子營養充足時，細胞中mTOR被大量激活并阻斷自噬通路[20]。mTOR是抑制自噬過程的一個主要因素，其主要通過磷酸化下游靶蛋白實現對自噬過程的抑制，足細胞mTOR的激活在DKD進展過程中表現出非常重要的作用，減少足細胞mTOR的激活可延緩DKD的進展[21]。mTOR可刺激缺氧誘導因子1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的堆積，進而促進血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌及表達，進而加速DKD的進展。Bax在病變生物體內呈低表達，參與機體內多種細胞的增殖、凋亡過程，其中細胞凋亡是一種主動連續的程序化反應，Bax過剩有助于細胞死亡[22]。本研究結果證實AMPK-mTOR信號通路參與糖尿病腎病足細胞損傷中自噬的調節，其機制可能為通過調節此信號通路相關蛋白進一步激活自噬，足細胞損傷情況也隨著自噬的激活而有所改善。

綜上所述，舒洛地特可通過下調miR-27a抑制AMPK-mTOR信號通路介導自噬調控糖尿病腎病足細胞損傷并發揮對足細胞的保護作用，為臨床治療DKD提供了新的理論依據，但具體機制還有待進一步的科學研究。

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（收稿日期：2020-06-03）