miRNA205 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療敏感性中的作用

尹 江，張志杰，賀智敏

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，廣東 廣州 510095）

微小RNA（miRNA 或者miR）是指一類由18～25 個(gè)核苷酸組成小分子非編碼RNA[1]。miRNA 通過(guò)與目的基因信使RNA（mRNA）3’UTR 完全或不完全配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因mRNA 的翻譯，最終抑制靶基因的蛋白表達(dá)[2]。人類編碼基因有超過(guò)60%的基因受到miRNA 的調(diào)控。在腫瘤細(xì)胞中，miRNA 常呈現(xiàn)出表達(dá)異常的現(xiàn)象[3]。在結(jié)腸癌患者組織中，miR506 在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織中的表達(dá)水平要高[4]。HBV 病毒蛋白可以抑制miR148a 的表達(dá)，可以導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成年人中最常見(jiàn)的原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增加。全球每年約30 萬(wàn)人被診斷患有神經(jīng)膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)瘤的臨床治療以手術(shù)治療為主，在安全范圍內(nèi)進(jìn)行最大程度的切除腫瘤組織，輔以放療和化療。放射治療在膠質(zhì)瘤的治療中發(fā)揮重要作用，能夠明顯延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存期。越來(lái)越多的研究表明miRNA 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。而miRNA205在膠質(zhì)瘤中的作用鮮有報(bào)道，且其是否參與膠質(zhì)瘤的放療抵抗有待揭曉，本研究試圖闡述miRNA205與膠質(zhì)瘤放療敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 購(gòu)自美國(guó)樣本典藏中心（ATCC）由本實(shí)驗(yàn)室保存；miRNA205 過(guò)表達(dá)及對(duì)照模擬物（miRNAmimic）、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；rH2AX、-actin 抗體購(gòu)自CST 公司（Cell Signalling Technology）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 的培養(yǎng)采用含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2濃度，飽和濕度。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞種植在在6 孔板中，每個(gè)孔種植105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%匯合度時(shí)將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基，采用脂質(zhì)體試劑Lipofectamine2000，按照操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染miRNA205 mimics 的細(xì)胞作為U251/miRNA205；轉(zhuǎn)染對(duì)照物miRNA control 的細(xì)胞為U251/NC。6 h 后再更換為含有血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)又稱RT-qPCR，將U251/NC 及U251/miR205 細(xì)胞采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，將2 μg 的總RNA 采用復(fù)能生物的All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄miRNA,采用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit 試劑盒，以U6 為內(nèi)參，進(jìn)行miRNA205 表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞U251/miRNA205 和對(duì)照組細(xì)胞U251/NC 分別種植6 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后未經(jīng)放射治療組為0Gy 組，或采用X 射線進(jìn)行放射治療的6Gy 組。轉(zhuǎn)移至正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至約含有50 個(gè)細(xì)胞的集落，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)各條件下細(xì)胞克隆數(shù)量并進(jìn)行分析。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的提取采用碧云天公司生產(chǎn)的RIPA 強(qiáng)裂解液。經(jīng)放療后的U251/miRNA205 和U251/NC 細(xì)胞，每隔4 h 收集并裂解，離心收集上清，經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度，煮沸變性后進(jìn)行Western Blot 分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各樣品的上樣量為30 μg 總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉TBST 溶液進(jìn)行封閉，抗體以說(shuō)明書比例采用一抗稀釋液稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，5 min/次，帶辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫條件下孵育2 h，ECL 發(fā)光，采用Tanon 化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞克隆統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析方法是t檢驗(yàn)，P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR 檢測(cè)miRNA205 的表達(dá)水平 采用RT-qPCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組U251/miRNA205 及對(duì)照組細(xì)胞U251/NC 細(xì)胞中miRNA205 的表達(dá)水平,其中U251/miRNA205 組△CT 值為（12.16±0.31），U251/NC組△CT 值為（15.65±0.39），△△CT 為（3.49±0.19）。經(jīng)計(jì)算U251/miRNA205 中miRNA205 的表達(dá)較U251/NC 細(xì)胞中miRNA205 的表達(dá)上調(diào)了（11.3±1.55）倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0003），見(jiàn)圖1。

圖1 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞中miRNA205 的表達(dá)水平

2.2 miRNA205 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療后的克隆形成對(duì)0Gy 組細(xì)胞形成的克隆數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，U251/NC形成的克隆數(shù)為（134.67±7.77），U251/miRNA205 形成的克隆數(shù)為（129.67±12.58），0Gy 組的U251/miR205 細(xì)胞的克隆數(shù)與U251/NC 組無(wú)明顯差異，P=0.59；而6Gy 組的細(xì)胞進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)顯示，U251/miR205 細(xì)胞形成的克隆數(shù)為（15±7.94）個(gè)，明顯少于U251/NC 細(xì)胞的克隆個(gè)數(shù)（37.33±5.86），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0172），見(jiàn)圖2。

圖2 miRNA205 抑制U251 細(xì)胞放療后克隆形成能力

2.3 miR205 抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)能力6 Gy的放射劑量均能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的DNA 損傷作用，且對(duì)U251/miRNA205 及U251/NC 的損傷程度相當(dāng)。24 h 時(shí)U251/NC 組細(xì)胞的DNA 損傷水平明顯下降，恢復(fù)到放療前水平，而U251/miRNA205 細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)能力變?nèi)酰?4 h 時(shí)DNA 損傷標(biāo)志物的表達(dá)水平仍處于，見(jiàn)圖3。

圖3 Western Blot 檢測(cè)rH2A.x 的表達(dá)水平

3 討論

miRNA 在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程均起到一定作用[1]。miRNA 主要通過(guò)與靶基因mRNA3’UTR 相互結(jié)合，抑制靶基因的翻譯或誘導(dǎo)靶基因mRNA 的降解，從而降低靶基因的表達(dá)水平。有研究表明miRNA205 可以通過(guò)抑制ZEB1 等基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的維持[6]。miRNA205 還能通過(guò)抑制ErbB 的表達(dá)從而導(dǎo)致靶向藥物的治療耐受。miRNA205 被認(rèn)為可以通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-9]。Chen W 等[10]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miRNA205 通過(guò)抑制ZEB1 發(fā)揮作用，抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中抑制MiR34a 的表達(dá)可以增強(qiáng)其體內(nèi)成瘤能力，上調(diào)miR497 的表達(dá)可以強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 對(duì)化療藥物替莫唑胺的敏感性[11]。因此miRNA 可以通過(guò)影響多種不同的信號(hào)通路發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miRNA205 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 的克隆形成能力無(wú)明顯影響。

放射治療是膠質(zhì)瘤等腫瘤重要且有效的治療手段，也是高級(jí)別膠質(zhì)瘤必要的治療方式之一，能夠明顯延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存期[12]。放射治療的作用機(jī)理主要是通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA 造成損傷，當(dāng)腫瘤細(xì)胞DNA 發(fā)生雙鏈斷裂時(shí)，無(wú)法修復(fù)的腫瘤細(xì)胞隨即發(fā)生凋亡或增殖停滯，從而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤的目的。當(dāng)DNA 發(fā)生雙鏈斷裂時(shí)H2A.x 被磷酸化成rH2A.x，因此rH2A.x 的表達(dá)水平可以作為DNA 損傷水平的標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中rH2A.x 的表達(dá)水平的變化，可以評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性及DNA 損傷修復(fù)能力[13]。對(duì)放射治療產(chǎn)生抵抗是導(dǎo)致放療失敗的主要原因，然而產(chǎn)生放療抵抗的機(jī)制尚不明確，也未有良好的治療方案增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miRNA205 的U251/miR205 細(xì)胞經(jīng)放射治療24 h 后，DNA 損傷標(biāo)志物未能明顯回復(fù)到放射治療前的狀態(tài)，而對(duì)照組U251/NC 細(xì)胞在放射治療24 小時(shí)后，DNA 損傷標(biāo)志物rH2A.X 能夠恢復(fù)到正常水平，提示miR205 能夠抑制U251 細(xì)胞中DNA 雙鏈斷裂的修復(fù)能力。平板克隆形成能力也是反映細(xì)胞放療敏感性的一個(gè)重要指標(biāo)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞放射治療發(fā)現(xiàn)，6 Gy 的放射治療后，對(duì)照組U251/NC 能形成（37±6）個(gè)克隆而過(guò)表達(dá)miRNA205 的實(shí)驗(yàn)組U251/miR205 細(xì)胞僅能形成（15±8）個(gè)細(xì)胞克隆，證實(shí)過(guò)表達(dá)miRNA205 能夠明顯抑制U251 細(xì)胞放療后的的克隆形成能力，提示miRNA205 具有促進(jìn)U251 細(xì)胞放療敏感性的作用。

綜上所述，miRNA205 能夠抑制U251 細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)能力，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 在放療后的克隆形成能力，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性增強(qiáng)。提示miRNA205 具有作為膠質(zhì)瘤放療增敏靶標(biāo)的價(jià)值。