anti-IL-33 對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖與凋亡的影響

姜 玥，劉宵達，吳素琴

（遼寧省基礎醫學研究所免疫研究室，遼寧 沈陽 110101）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性和全身性炎癥性疾病，以成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的病理性增生、滑膜炎癥和血管痙攣、軟骨和骨破壞以及全身性表現為主要特征[1]。促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、IL-6 和IL-17，通過激活巨噬細胞、FLS、輔助性T（Th）細胞和破骨細胞，誘導關節炎癥反應及骨和軟骨的破壞[2，3]。在RA中TNF-α 參與多種致病機制，如內皮細胞的激活、白細胞的聚集、PGE2的產生、促炎細胞因子和趨化因子的釋放、破骨細胞的活化等，進而導致滑膜組織的增生、炎癥、骨和軟骨的破壞、自身免疫反應以及RA 并發癥等病理過程[4]。IL-33 屬于IL-1 細胞因子家族成員[5]，其最初被描述為一種由壞死的上皮細胞和內皮細胞被動釋放的細胞因子，后發現巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞、成纖維細胞、滑膜細胞中均有IL-33 表達。IL-33 能激活肥大細胞，促進中性粒細胞遷移、產生趨化因子和巨噬細胞產生促炎細胞因子，參與了RA 的炎性環境[6]。本研究主要探討anti-IL-33 對RA 滑膜細胞的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 二氧化碳培養箱（Thermo Heracellvios160i，美國Thermo 公司），倒置顯微鏡（AxioVert.Al，德國ZEISS 公司），低溫高速離心機（X-30R，美國Beckman Coulter 公司），高壓蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫療器械有限公司），酶標儀（318C，上海三科儀器有限公司），流式細胞儀（CytoFlex，美國Beckman Coulter 公司）。

1.1.2 細胞、試劑 兔抗人IL-33 抗體（PeproTech 公司，美國），TNF-α（PeproTech 公司，美國），甲氨蝶呤片（上海信誼制藥總廠，中國），胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司，中國），人FLS（上海弘順公司，中國），青霉素鏈霉素雙抗（聯邦生物試劑有限公司，中國），高糖DMEM 培養基（HyClone 公司，美國），胰蛋白酶（HyClone 公司，美國），PBS（HyClone 公司，美國），CCK-8 試劑盒（索萊寶試劑有限公司，中國），凋亡試劑盒（Biolegend 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 FLS 置于37 ℃5%CO2培養箱中，含10%胎牛血清H-DMEM 培養基培養（含1%青鏈霉素），取3～7 代對數生長期細胞正式實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測 將FLS 細胞制備適當濃度的細胞懸液（5×103/ml），以每孔100 μl 接種至96 孔培養板培養。除正常對照組外，其余各組均加入TNFα（20 ng/ml）誘導，實驗具體分組如下：正常對照組、TNF-α（+）對照組、TNF-α（+）+anti-IL-33（50 ng/ml）組、TNF-α（+）+甲氨蝶呤（1 μg/ml）組。每組4 個復孔，24 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，將培養板置于細胞培養箱內37 ℃5%的CO2條件下孵育4 h，酶標儀測定450 nm 處的吸光度。計算各組的細胞存活率，公式如下：細胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）]×100。

1.2.3 流式細胞術檢測 將1×106/ml FLS 細胞接種于6 孔培養板，誘導及分組方法同上1.2.2，每組4 個復孔。24 h 后，收集各孔細胞，包括培養上清中的細胞，PBS 洗滌，調節濃度為1×106/ml，將100 μl 細胞懸液加入流式管，加入5 μl FITC-Annexin V 以及10 μl PI 室溫避光孵育15 min，加400 μl Cell Staining Buffer，上機檢測各組細胞凋亡情況。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計學軟件對實驗數據進行分析，采用GraphPad Prism8.0 軟件進行作圖。計量資料以（）表示，符合正態分布的多組之間參數比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 anti-IL-33 對RA-FLS 形態的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細胞表現為長梭形，且細胞間隙顯著減小；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤（1 μg/ml）組細胞形態均由長梭形逐漸變圓，胞核色素沉著，細胞間隙增加，見圖1。

圖1 anti-IL-33 對RA-FLS 形態的影響（×200）

2.2 anti-IL-33 對RA-FLS 增殖的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細胞活力增加（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細胞活力降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測anti-IL-33 對RA-FLS 增殖的影響

2.3 anti-IL-33 對RA-FLS 凋亡的影響 與正常對照組比較，TNF-α（+）對照組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細胞凋亡率增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測anti-IL-33 對RA-FLS 細胞凋亡的影響

3 討論

RA 是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎、骨組織破壞伴隨血管翳的形成和關節軟骨的降解。IL-33/ST2 信號傳導與多種疾病的發病機制有關，包括哮喘、纖維增生性疾病和自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、進行性全身性硬化癥等。研究表明[7]，IL-33/ST2 參與RA 的發病機制。

Matsuyama Y 等[8]研究表明，IL-33 與RA 發病密切相關，RA 患者血清和滑膜液中IL-33 的表達增加，IL-33mRNA 高表達于滑膜細胞，且IL-33 與RA疾病活動呈正相關（P＜0.05）。Li Y 等[9]研究表明，抗IL-33 抗體能夠抑制干擾素-γ（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-33 和TNF-α 的表達，并減輕膠原誘導的關節炎（CIA）小鼠隨后出現的關節損壞，提示用IL-33中和抗體治療關節炎是一項具有發展前景的新方法，IL-33 中和抗體通過抑制炎性細胞的活化和抑制促炎細胞因子的產生，有助于緩解關節損傷情況，對關節炎的發作具有治療作用。目前，諸如阿達木單抗等生物制劑抗風濕藥物顯示出優越的臨床效果。本研究主要探討anti-IL-33 對RA 滑膜細胞的影響，通過檢測各組細胞增殖、凋亡水平，結果顯示與對照組比較，TNF-α（+）對照組細胞活力增加（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細胞活力降低（P＜0.05）。凋亡檢測顯示，與對照組比較，TNF-α（+）對照組細胞凋亡降低（P＜0.05）；與TNF-α（+）對照組比較，TNF-α（+）+anti-IL-33 組和TNF-α（+）+甲氨蝶呤組細胞凋亡率增高（P＜0.05），提示anti-IL-33 能改善在TNF-α 刺激下的RA-FLS 大量增殖，并能促進RA-FLS 凋亡，推測anti-IL-33 在RA 患者體內能抑制滑膜的增厚，并抑制形成大量的血管翳，這些對于緩解RA 病情，降低RA 中軟骨及骨的降解都有明顯優勢。因此，阻斷IL-33 的生物制劑有希望成為治療RA 的新途徑，anti-IL-33 是否通過OPG/RANKL 影響RA 值得進一步深入研究。

綜上所述，anti-IL-33 可抑制RA-FLS 增殖并誘導其凋亡，可為RA 的治療提供方向。