鮮切西瓜水漬化損傷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

鄭雪夢(mèng)，時(shí) 月，張 超，王雪敏

（1.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲056006；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心，北京100097；3.果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097）

0 引言

鮮切西瓜是以新鮮西瓜為原料，經(jīng)清洗、去皮、切塊和包裝等工序生產(chǎn)的即食果蔬制品，具有新鮮、營(yíng)養(yǎng)、方便、無廢棄物等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，鮮切西瓜是主要的消費(fèi)形式，消費(fèi)量占西瓜消費(fèi)量的60%以上；在我國(guó)鮮切西瓜僅占西瓜總消費(fèi)量的1%以下，主要供應(yīng)于商超。目前，我國(guó)的鮮切西瓜產(chǎn)業(yè)正處于快速發(fā)展階段，有望在未來5年成為西瓜主要消費(fèi)形式，但水漬化損傷阻礙鮮切西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

水漬化損傷的特征是果肉溶質(zhì)泄漏增加，果肉顏色變深變軟[4]，常見于葫蘆科植物的果實(shí)。果實(shí)經(jīng)鮮切處理后，組織發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而引起一系列的生理紊亂現(xiàn)象。研究表明，鮮切甜瓜呼吸速率增加，伴隨活性氧的積累，其能量水平提高，在貯藏過程中伴隨產(chǎn)生了較高的氧化應(yīng)激和膜損傷[5]。鮮切西瓜水漬化損傷表現(xiàn)為果實(shí)顏色顯著增加，硬度顯著降低，口感和氣味均發(fā)生劣變，嚴(yán)重影響其商品性[2，6-7]。目前，關(guān)于西瓜水漬化損傷的研究都集中在外源乙烯誘導(dǎo)和1-MCP預(yù)防[8-11]，對(duì)果實(shí)硬度、相對(duì)電導(dǎo)率、磷脂酶、脂氧合酶活性進(jìn)行測(cè)定，缺乏對(duì)果實(shí)分子代謝方面的研究。

隨著高通量測(cè)序平臺(tái)發(fā)展和西瓜全基因組測(cè)序完成，RNA-Seq已經(jīng)成為了監(jiān)測(cè)研究對(duì)象在各種環(huán)境條件下轉(zhuǎn)錄組水平的工具[12]。該技術(shù)通過對(duì)不同成熟期黃皮和綠皮西瓜樣品分析，明確了與西瓜果皮色澤相關(guān)差異基因[13]。通過對(duì)西瓜果實(shí)含糖量性狀QTL精細(xì)定位，明確西瓜果實(shí)糖分積累的相關(guān)機(jī)制[14]。該技術(shù)結(jié)合權(quán)重共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出與乙烯信號(hào)通路及上游調(diào)控的關(guān)鍵基因，闡明西瓜成熟與乙烯調(diào)控的關(guān)系[15]。該技術(shù)通過對(duì)西瓜果實(shí)發(fā)育期的RNA樣品分析，明確了西瓜果肉硬度和果實(shí)有機(jī)酸積累的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]，分析了西瓜抗裂果和感裂果的差異表達(dá)基因，為西瓜裂果的分子機(jī)理提供基因信息[17]。但是，關(guān)于鮮切西瓜貨架期內(nèi)水漬化損傷的分子機(jī)制方面的還鮮有報(bào)道。

以京欣3號(hào)西瓜為材料，以未水漬化西瓜作為對(duì)照組，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析水漬化果肉和未水漬化果肉的差異基因，探討鮮切西瓜水漬化損傷機(jī)制，挖掘出與水漬化相關(guān)的關(guān)鍵基因，為保持鮮切西瓜品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

京欣3號(hào)西瓜，京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司提供；選擇新鮮、果實(shí)大小適中、成熟度一致、無生理病害、無機(jī)械損傷的西瓜作為試驗(yàn)材料。

1.2 鮮切西瓜處理方法

使用蒸餾水清洗西瓜表面灰塵，再使用150 μL/L次氯酸鈉溶液清洗2 min，蒸餾水漂洗2次，靜置瀝水。在超凈工作臺(tái)下，將西瓜縱向切開，去除果皮等不可食用部位，將果肉切割成邊長(zhǎng)約3 cm的小果塊，混合均勻，裝入聚乙烯保鮮盒內(nèi)，每盒約300 g，放置于4℃的冷藏柜中貯藏，觀察水漬化損傷情況。

京欣3號(hào)西瓜4℃貯藏表型鑒定見圖1。

圖1 京欣3號(hào)西瓜4℃貯藏表型鑒定

由圖1可知，貯藏第5天的鮮切京欣西瓜果肉呈現(xiàn)出明顯的水漬化現(xiàn)象，果肉顏色加深、果塊邊緣及瓜子周圍呈現(xiàn)水漬狀、果肉軟化。取冷藏5 d的西瓜果塊于無菌操作臺(tái)內(nèi)分別取樣水漬化果肉和未水漬化果肉，液氮速凍，保存于-80℃冰箱，備用。以未水漬化果肉作為CK組，水漬化的果肉作為WS（water-soaking）組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為確保轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)處理組作3次重復(fù)，分別標(biāo)記為CK1，CK2，CK3，WS1，WS2和WS3。

1.2.1 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序

采用TRIzol法提取組織中的總RNA，利用Nanodrop2000對(duì)所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，Agilent2100測(cè)定RIN值[18]。RNA檢測(cè)合格后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、高通量測(cè)序和序列組裝工作。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)各樣本的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data），與西瓜97103基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)量計(jì)算等的mapped reads，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用軟件RSEM分別對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，定量指標(biāo)為TPM（Transcripts Per Millionreads）。利用基于負(fù)二項(xiàng)分布模型的DESeq2軟件，以p-adjust＜0.05 &|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。

1.2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG富集分析

GO數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，基因本體數(shù)據(jù)庫）可將基因按照生物過程（Biological Process）、細(xì)胞組分（Cellular Componen）t和分子功能（Molecular Function）進(jìn)行分類。

KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）可系統(tǒng)分析基因功能，將基因按照參與的pathway通路或行使的功能分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

通過Illumina平臺(tái)對(duì)果肉樣本測(cè)序，使用SeqPrep和Sickle軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，測(cè)序結(jié)果顯示6個(gè)樣品共獲得48.53 Gb原始數(shù)據(jù)，通過過濾和質(zhì)控后，共得到47.02 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均在7.16 Gb以上，測(cè)序堿基平均錯(cuò)誤率均在0.025 3%以下，Q30堿基比例在93.89%以上，測(cè)序質(zhì)量具有較高的可靠性，可用于下一步的分析。

西瓜果肉樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表1，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。

表1 西瓜果肉樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

分別將各樣品的過濾后讀長(zhǎng)與西瓜97103基因組（Watermelon_97103）進(jìn)行序列比對(duì)，表2顯示樣品比對(duì)率均大于74.00%，比對(duì)效率較高。測(cè)序質(zhì)控和序列比對(duì)數(shù)據(jù)說明，6個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)生物學(xué)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 基因表達(dá)量分析

西瓜樣本關(guān)系分析見圖2。

圖2 西瓜樣本關(guān)系分析

通過相關(guān)性熱圖，對(duì)樣本間基因表達(dá)量的生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估，將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為評(píng)估指標(biāo)，r2越接近1，說明2個(gè)重復(fù)樣品相關(guān)性越強(qiáng)。圖2（a）顯示每個(gè)樣本間的3次生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性較強(qiáng)，且對(duì)照組與水漬化組之間相關(guān)性較強(qiáng)，其中京欣西瓜水漬化樣本的3個(gè)組間重復(fù)相關(guān)性最好。同時(shí)，對(duì)6個(gè)樣本的基因表達(dá)量進(jìn)行主成分分析，找出離群樣本，判別相似性高的樣品簇。如圖2（b）所示，相同處理的樣本之間聚集在一起，相似度較高，而不同處理之間基因表達(dá)差異顯著，分別形成不同的集群，與圖2（a）結(jié)果一致。

2.3 差異表達(dá)基因分析

利用基于負(fù)二項(xiàng)分布模型的DESeq2軟件，以p-adjust＜0.05 &|log2差異倍數(shù)|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。結(jié)果如表3所示，2組間共有491個(gè)基因差異表達(dá)，其中305個(gè)基因上調(diào)表達(dá)、186個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

差異基因表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 差異基因表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)/個(gè)

2.4 差異表達(dá)基因的GO功能注釋

差異表達(dá)基因的GO功能分類見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能分類

利用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行了GO功能注釋分類。上調(diào)基因主要注釋在催化活性、結(jié)合、代謝過程、細(xì)胞過程、膜部分、細(xì)胞部分、膜、生物調(diào)節(jié)條目。下調(diào)基因主要注釋在結(jié)合、代謝過程、催化活性、細(xì)胞過程、膜部分、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器條目。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

生物個(gè)體在行使其生物學(xué)功能時(shí)，往往需要不同層面的基因共同協(xié)調(diào)完成，通過對(duì)代謝通路的分析，可以更好地揭示差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。對(duì)京欣水漬化與京欣未水漬化的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能注釋，共注釋在代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細(xì)胞過程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）五大類別。

差異表達(dá)基因的KEGG功能分類見圖4。

圖4 差異表達(dá)基因的KEGG功能分類

上調(diào)基因主要注釋在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、能量代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、環(huán)境適應(yīng)等通路。下調(diào)基因主要注釋在能量代謝、碳水化合物代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、環(huán)境適應(yīng)、脂質(zhì)代謝、其他氨基酸的代謝、核苷酸代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、膜運(yùn)輸、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡等通路。

差異表達(dá)基因的KEGG富集分析見圖5。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

進(jìn)一步對(duì)差異基因代謝通路進(jìn)行顯著性富集分析。上調(diào)基因在角質(zhì)、琥珀和蠟的生物合成、甘油脂代謝通路上顯著富集，在苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、類黃酮生物合成、光合生物中的碳固定、磷酸肌醇代謝、苯丙氨酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物、細(xì)胞衰老等通路也有較高富集。下調(diào)基因顯著富集在光合作用-天線蛋白、光合作用、DNA復(fù)制代謝通路上，在MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物、同源重組、糖酵解/糖異生、光合生物中的碳固定、磷酸戊糖途徑、細(xì)胞衰老等通路也有較高富集。

2.6 與水漬化損傷相關(guān)的候選基因篩選

與水漬化損傷有關(guān)差異基因的表達(dá)分析見表4。

由表4可知，篩選了可能與水漬化損傷有關(guān)的差異基因。

表4 與水漬化損傷有關(guān)差異基因的表達(dá)分析

果膠、半纖維素、纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，決定了果實(shí)硬度。果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶是植物細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶，參與藍(lán)莓[19]、梨[20]、甜瓜[21]、櫻桃[22]細(xì)胞壁降解，促進(jìn)果實(shí)軟化。在研究中發(fā)現(xiàn)在水漬化西瓜中上調(diào)了果膠酯酶（Cla021324，Cla021325）、果膠裂解酶（Cla021445，Cla009870）、多半乳糖醛酸酶（Cla015246）基因的表達(dá)，促進(jìn)西瓜果肉細(xì)胞壁降解、果肉硬度下降。

乙烯有促進(jìn)器官脫落和衰老的作用，鈣參與維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)形狀和細(xì)胞膜的完整性，鈣通過在果膠聚合物之間建立橋梁來穩(wěn)定細(xì)胞壁。乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝過程和植物的抗脅迫能力具有重要的調(diào)控作用[23]。鈣調(diào)蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，介導(dǎo)細(xì)胞活動(dòng)。發(fā)現(xiàn)2個(gè)乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（Cla021525，Cla007578）基因表達(dá)上調(diào)，一個(gè)鈣調(diào)蛋白（Cla012165）基因表達(dá)下調(diào)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

碳水化合物是生命細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分及主要供能物質(zhì)，并且有調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的重要功能。磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，丙酮酸是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，蔗糖合酶是植物糖代謝過程的關(guān)鍵酶，催化蔗糖的合成與分解。發(fā)現(xiàn)2個(gè)6-磷酸果糖激酶（Cla012643，Cla014418）、3個(gè)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Cla000142，Cla002312，Cla023334）、1個(gè)蔗糖合酶基因（Cla018637）參與糖代謝過程。

磷脂雙分子層是構(gòu)成細(xì)胞膜的的基本支架，磷脂酶在磷脂分解代謝中起重要作用，參與細(xì)胞膜代謝[24]。發(fā)現(xiàn)有2個(gè)磷脂酶（Cla020303，Cla009682）基因上調(diào)表達(dá)，參與細(xì)胞衰老。

3 結(jié)論

鮮切西瓜水漬化損傷是一個(gè)多基因參與、多種代謝過程相互影響的復(fù)雜過程，Mao L等人[10]發(fā)現(xiàn)50 μL/L外源乙烯處理的20℃貯藏的西瓜果實(shí)呈現(xiàn)水漬化狀，果實(shí)電導(dǎo)率、游離汁液增加、組織軟化，且經(jīng)乙烯處理的西瓜中ACC合成酶、ACC氧化酶、磷脂酶C、磷脂酶D和脂氧合酶的活性明顯提高，推測(cè)西瓜果實(shí)的水漬化敗壞是一種由乙烯誘導(dǎo)的衰老現(xiàn)象。利用RNA-seq分析了鮮切京欣3號(hào)西瓜4℃貨架期貯藏5 d的水漬化果肉/未水漬化果肉的基因表達(dá)差異。與CK相比，水漬化樣本有305個(gè)上調(diào)基因和186個(gè)下調(diào)基因。差異基因GO注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要注釋在代謝過程、細(xì)胞過程、催化活性、結(jié)合這4個(gè)GO條目，上調(diào)基因數(shù)目大于下調(diào)基因數(shù)目。差異基因KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集在碳水化合物代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、脂質(zhì)代謝等途徑上。

碳水化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的一類重要有機(jī)物，占植物干質(zhì)量的50%以上，主要由植物進(jìn)行光合作用產(chǎn)生。糖在生物體內(nèi)經(jīng)一系列的降解而釋放大量的能量供生命活動(dòng)之需要。差異基因主要注釋在戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝通路，未水漬化損傷果肉中上調(diào)果糖激酶基因和蔗糖合酶基因的表達(dá)，促使6-磷酸果糖磷酸轉(zhuǎn)化，催化蔗糖合成和分解，生成更多能量，維持細(xì)胞生命活動(dòng)。

成熟植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成。這些多糖化合物在果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等細(xì)胞壁降解酶作用下分解，促進(jìn)果實(shí)軟化。研究中發(fā)現(xiàn)，在水漬化西瓜中上調(diào)了果膠酯酶、果膠裂解酶、多半乳糖醛酸酶基因的表達(dá)。

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物是差異基因富集的重要代謝通路。曹聲海[25]發(fā)現(xiàn)乙烯可能通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)月季花朵衰老。鈣調(diào)蛋白能與鈣結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[26]。與CK相比，水漬化果肉上調(diào)了乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，下調(diào)了鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞衰老。

磷脂酶在植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)答中都起著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn)組織受傷或遭受病原侵染后，磷脂酶介導(dǎo)的磷脂快速水解反應(yīng)在傷口處被激發(fā)[27]。與CK相比，水漬化果肉中磷脂酶基因上調(diào)表達(dá)，可能與細(xì)胞應(yīng)對(duì)水漬化損傷相關(guān)。

目前，研究發(fā)現(xiàn)西瓜水漬化損傷與碳水化合物代謝、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝相關(guān)，研究結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平為解析鮮切西瓜水漬化的分子機(jī)理提供參考，為挖掘鮮切西瓜水漬化的關(guān)鍵功能基因提供基因資源。