紅螯螯蝦養殖群體遺傳多樣性的SSR分析

金 玲，陳奕彬，李色東,5，劉 萍，李 健，呂建建

(1.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，青島 266071；3.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，青島 266235；4.廣東恒興飼料實業股份有限公司，廣東湛江 524022；5.湛江市海洋與漁業發展研究中心，廣東湛江 524039)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)原產于澳大利亞北部，俗稱澳洲淡水龍蝦，屬于節肢動物門甲殼綱十足目擬螯蝦科，是世界上最名貴的淡水經濟蝦種之一[1]。它具有個體大，食性雜，生長快，病害少，適應能力強等養殖優勢。因其可食用部分比率高、肉味鮮美、營養價值高而廣受歐美等國家歡迎[2,3]。我國內地最早于1992年廣東珠海進行試養，隨后在福建、江蘇、浙江、江西、廣西等地進行了小規模試養，產業整體處于初級階段。目前，良種稀缺、親蝦品質良莠不齊等因素嚴重制約了紅螯螯蝦養殖業的發展[4]。

遺傳多樣性是遺傳選育的基礎[5]。目前國內關于經濟甲殼類物種的不同地理群體遺傳多樣性分析已有不少的報道，如中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[6]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[7]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)等[8]。開展遺傳多樣性和遺傳結構分析對于了解紅螯螯蝦種質資源現狀、育種潛力及制定育種方案具有重要意義[9]。

微衛星(Microsatellite)又稱簡單重復序列(Simple sequence repeats,SSR)，因其多態性高、屬于共顯性遺傳、操作便捷等特點，目前已被廣泛應用于水產動物的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、遺傳結構和親緣關系分析等研究[10-12]。Baker等[13]最早開發了紅螯螯蝦7個微衛星位點。隨后，謝艷楠[14]開發了28個微衛星位點，并對福建廈門、廣東廣州、上海崇明3個不同地理位置的紅螯螯蝦養殖群體進行了遺傳結構分析。然而，自2011年以來，我國紅螯螯蝦群體遺傳多樣性是否發生改變或降低，亟需提供最新的遺傳多樣性分析數據。

本研究利用微衛星分子標記對我國廣東和臺灣兩個主要的紅螯螯蝦養殖群體進行分析，旨在了解兩個群體的遺傳多樣性信息和遺傳結構，同時為后續的紅螯螯蝦種質資源評估及利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的紅螯螯蝦群體分別來自廣東和臺灣。每個群體30尾，雌雄比為1 ∶1。取背部適量的肌肉樣品共60份，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用TransGen Biotech的基因組DNA提取試劑盒，根據其說明書提取紅螯螯蝦DNA，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，微量分光光度計測其濃度，-20℃保存備用。

1.2.2 微衛星引物的篩選與條件優化

本實驗所用引物序列均為之前已報道的SSR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。利用梯度PCR方法篩選SSR引物并確定其最適退火溫度，最終獲得10對符合實驗要求的引物(表1)。

1.2.3 PCR反應及檢測

具體實施步驟如下：由3條引物進行PCR擴增，第1條是5′端帶有M13尾的正向引物(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)；第2條是SSR反向引物；第3條是帶有熒光標記的M13 通用引物(5′端用FAM、HEX、ROX熒光基團標記)。以上所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物準備就緒后利用篩選出的10個位點對60個紅螯螯蝦基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 3.2μL，M13正向引物(10 μmol/L) 0.4μL，反向引物(10 μmol/L) 1.6 μL，M13熒光引物(10 μmol/L) 1.6 μL，DNA模板小于1 μg，ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s；引物在各自退火溫度下復性30 s；72 ℃延伸1 min；34個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。對PCR產物進行凝膠檢測并觀察其條帶，將符合條件的PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行基因分型。

1.3 數據分析

運用PopGene3.2[15]軟件來分析等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon指數(H)等；觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態信息含量(PIC)以及Hardy-Weinberg平衡(P)檢驗等遺傳多樣性參數則利用Cervus 3.0.7軟件完成；用公式D=(Ho-He)/He計算遺傳偏離系數(D)[16]；用FSTAT[17]軟件計算近交系數(Fis)以及群體間的遺傳分化指數(Fst)。

2 結果

2.1 SSR標記在兩個群體中的分型

本研究對廣東和臺灣紅螯螯蝦養殖群體進行微衛星分型(圖1)。10個微衛星位點在2個養殖群體中共檢測到83個等位基因，各個位點的Na介于3～17之間，其中位點HAo22數量最多(Na=17)，位點HAo04數量最少(Na=3)；Ne范圍為1.180～4.699，平均Ne為2.784(表2)。廣東和臺灣養殖群體在10個位點上的平均Na均為6；平均Ne分別為2.619和2.829(表3)。

表2 10個微衛星位點上的遺傳多樣性參數

表3 2個紅螯螯蝦群體在10個微衛星位點上的遺傳多樣性參數比較

2.2 兩個群體的遺傳多樣性分析

兩個紅螯螯蝦群體的平均Ho為0.464，平均He為0.557；PIC介于0.146～0.770之間，平均PIC為0.517，其中位點HAo22最高，位點HAo03最低(表2)。結果表明10個位點中6個位點顯示高度多態性(PIC>0.50)，2個位點顯示中度多態性(0.25

表4 2個紅螯螯蝦群體10個微衛星位點的遺傳多樣性指數及近交系數

2.3 群體間的遺傳分化及近交系數評估

對紅螯螯蝦2個群體的遺傳分化指數Fst值進行分析，廣東群體和臺灣群體間的Fst為0.0969，屬于中等程度的分化(0.05

3 討論

遺傳多樣性分析結果表明，廣東群體平均PIC為0.465，呈中度多態性，而臺灣群體的平均PIC為0.517，呈高度多態性。整體而言，國內兩個群體的遺傳多樣性水平較高。謝雁南等[14]利用微衛星分子標記對廈門、廣州、崇明3個紅螯螯蝦養殖群體進行了遺傳多樣性分析，結果顯示三個群體的平均PIC為0.451 ～ 0.480。該結果與本研究結果相似，表明經過近十年的累代養殖，國內紅螯螯蝦養殖群體仍保持在較高的遺傳多樣性水平。然而，相較Baker等[18]已報道的澳大利亞野生種群，國內養殖群體的遺傳多樣性水平確有一定程度的下降，說明在今后的選育或保種過程中，仍需制定科學、合理的方案，以維持較高的群體多樣性水平。

Shannon指數H是判定遺傳多樣性水平的重要指標[19]，根據Shannon多樣性指數，廣東群體和臺灣群體分別為1.069、1.192，進一步說明兩群體的遺傳多樣性較為豐富。Fst是反映群體間遺傳分化程度的重要參數。本研究中，紅螯螯蝦群體間的Fst值為0.0969，為中等程度遺傳分化(0.05

本研究通過微衛星標記對廣東和臺灣紅螯螯蝦養殖群體進行分析，得到其群體間的遺傳多樣性等信息。研究結果為紅螯螯蝦的遺傳多樣性評估、遺傳選育提供數據參考，有助于推動紅螯螯蝦種質資源的合理保護與利用。