基于板藍根顆粒需氧菌總數計數的藥品微生物檢測能力驗證研究

肖 璜，戴 翚，周發友，馬仕洪

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

藥品微生物限度檢查于1972 年在國內起步，衛生部1978 年頒布了首個藥品微生物限度標準，1995 年版《中國藥典》首次收載了微生物限度檢查法，2000 年版《中國藥典》首次收載了微生物限度標準，2005 年版《中國藥典》強調了藥品微生物檢驗中的“方法驗證”，以避免因方法不合理而造成漏判、誤判。2015 年版《中國藥典》解決了與人用藥品注冊技術要求國際協調會議（ICH）協調案的協調問題，實現了與國際標準的全面接軌，強化了操作關鍵點的控制［1］。我國藥品微生物限度檢查起步較早，標準已對標國際，但因實驗室條件、人員技術水平、對標準和方法的理解存在差異，故各實驗室微生物限度檢測能力不同［2－5］。文獻［6］報道，地方藥品檢驗系統食品菌落總數計數能力驗證能力需加強。需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）上生長的總菌落數（包括真菌菌落數）［7］，是藥品微生物限度檢查的重要項目，用以判斷樣品被微生物污染的程度，反映藥品生產、運輸、儲存等環節質量的優劣。能力驗證是利用實驗室間的比對，按預先制訂的準則評價參與者的能力［8－9］。實驗室比對是指按預先規定的條件，由 2 個或多個實驗室對相同或類似的測試樣品進行檢測的組織、實施和評價［8］，是國際通行的實驗室質量控制和認可機構確認實驗室能力的有效技術手段。2015 年版《中國藥典》［7］也明確，在外部質量控制評估中，實驗室應參與能力驗證來評估檢測能力的水平，通過參加外部質量評估來評定檢測結果的偏差。實驗室對評估結果進行分析后可適時改進。質控樣品的均勻性和穩定性是能力驗證項目實施的關鍵［6，10－14］。本研究中通過考察板藍根顆粒菌落總數樣品（小樣和正式樣品）的均勻性，以及儲藏、運輸的穩定性來確保其滿足能力驗證要求。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與菌株

儀器：SJ－CJ－2FD 型超凈工作臺，BHC1300ⅡA2型生物安全柜，均購于阿爾泰實驗室設備＜北京＞有限公司；BCD－118TMPA 型海爾電冰箱（海爾智家股份有限公司）；LT－CPS80C 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（立德泰克力＜上海＞科學儀器有限公司）；DZX－50KB 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；ZXDP－A2270型恒溫培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；DN－300M 型生物顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司）；ZYO－0.5 型藥用真空冷凍干燥機（上海東富龍科技股份有限公司）。

試劑：冷凍保護液（溫州微穹微生物技術有限公司）；TSA 培養基（賽默飛世爾科技公司）。

菌株：萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus，ATCC 9372，美國醫學菌株保藏管理中心）；短小芽孢桿菌［ Bacillus pumilus，CMCC（B）63202，中國醫學細菌保藏管理中心］。

1.2 樣品制備及考察

1.2.1方案設計

樣品為鋁塑袋包裝的板藍根顆粒，設置陽性和陰性兩組樣品。陰性樣品用于方法驗證，計數結果無需上報；陽性樣品用于開展試驗，計數結果上報。試驗參照《NIFDC－PT－196 板藍根顆粒需氧菌總數能力驗證作業指導書》（以下簡稱《作業指導書》）進行。

1.2.2 樣品制備

陰性樣品：板藍根顆粒在裝袋前滅菌，直接用鋁箔袋包裝，每袋10 g。

陽性樣品：將菌株培養成孢子并收集，制成孢子懸液，通過純化使其最終的孢子形成率大于95%；孢子懸液再通過80 ～85 ℃高溫處理15 min，得到穩定可靠的孢子，計數制得的孢子懸液；混懸均勻的孢子懸液，按目標菌數加入板藍根顆粒樣品中；板藍根顆粒在混入凍干菌株前應滅菌，確保板藍根初始污染水平一致。

1.2.3 樣品考察

因為定量樣品的均勻性和穩定性對于后期試驗結果回收影響大，故制備了2 批樣品。小樣制備量為100 個，正式樣品制備量為600 個。按照《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》（CNAS － GL03）［10］，采用單因素分析法檢驗樣品的均勻性，當 F 值 ＜ F 臨界值（ F0.05）時，認為樣品制備充分均勻。采用 t 檢驗法進行穩定性考察，當 ｜tstat｜值 ＜ t 單尾臨界值（ t0.05）時，表明考察期內樣品穩定。

均勻性：1）小樣，在制作過程的前、中、后取10 個樣品檢查制作的均勻性。2）正式樣品，在制作過程的前、中、后取40 個樣品檢測制作的均勻性。

穩定性：1）小樣。取24 個樣品監控37 ℃高溫模擬運輸72 h 的穩定性，檢查其中6 個樣品；取18 個樣品監控室溫90 d 保存的穩定性，檢查其中6 個樣品；取18個樣品監控4 ℃、90 d 保存的穩定性，檢查其中6 個樣品。2）正式樣品。結合小樣的穩定性監控結果、發樣時間（2019 年 9 月 24 日至 9 月 26 日）和據報名預測運輸時間（偏遠地區6 d），增加37 ℃高溫模擬運輸144 h 和45 ℃高溫模擬運輸97 h 的穩定性監控，各檢查6 個樣品。

1.3 計劃實施

1.3.1 參加機構

全國共152 個實驗室，涉及31 個省（市）、自治區，地域和單位屬性分布見表1。本次能力驗證主要以食藥監系統實驗室為主。

表1 參加機構地域和單位屬性分布（個）Tab.1 Geographical and unit attribute distribution of participating institutions（unit）

1.3.2 隨機編號

由中國藥檢能力驗證服務平臺（以下簡稱平臺）對參與實驗室樣品進行隨機編號。

1.3.3 運輸包裝

選擇聚乙烯自封袋包裝產品，雙人雙核，再用防撞袋包裝，放入隔熱聚乙烯泡沫箱，每個箱內放置4 個冰袋，打包后當天運輸。

1.3.4 檢測方法

《作業指導書》中明確規定樣品保存于2 ～8 ℃，供試品制備需將鋁塑袋打開，整體轉移至90 mL 滅菌氯化鈉蛋白胨溶液，作為1 ∶10 供試品溶液，保證樣品分散均勻。規定按照2015 年版《中國藥典（四部）》通則中“1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”項下平皿法（傾注法），平行測定兩皿。結果須通過平臺上報，報告測定平行計數結果和樣品中需氧菌總數（cfu／g）。

1.3.5 結果評價原則

根據回收的實驗室結果，將報告值顯著低于預期的判定為離群值，予以剔除。以其他數據的對數中位值作為指定值，以對數中位值 ± 0.5 作為能力評定標準［15］。

本次樣品考核的結論設為滿意、不滿意。滿意：在規定截止日期上報結果，對數中位數－0.5≤報告值的對數值≤對數中位數＋0.5。不滿意：1）在規定截止日期未上報結果，且未主動與實施方進行溝通；2）因樣品損毀，上報結果為未開展實驗；3）在規定截止日期上報結果，報告值為異常值（為零，或數量級存在差異）；4）在規定截止日期內上報結果，報告值的對數值＞對數中位數＋0.5或報告值的對數值＜對數中位數－0.5。符合上述4 項中其中1 項即可判定為不滿意。

2 結果與分析

2.1 均勻性結果

結果見表 2 和表 3。小樣 F0.05＝ 3.02，計算 F ＝0.64 ＜ F0.05，表明差異無統計學意義，小樣的菌落數組間均勻；正式樣品 F0.05＝ 1.70，計算的 F ＝ 1.06 ＜ F0.05，表明差異無統計學意義，正式樣品的菌落數組間均勻。由兩輪次樣品的均勻性試驗結果可見，制備工藝可靠，樣品均勻性符合要求。

表2 小樣單因子方差分析結果Tab.2 Results of one－way ANOVA of small sample

表3 正式樣品單因子方差分析結果Tab.3 Results of one－way ANOVA of formal samples

2.2 穩定性結果

結果見表 4 和表 5。小樣 t0.05＝2.02，計算 t4℃，90d＝1.99，t室溫，90 d＝ 0.75，t37℃，72h＝ 1.16，均小于 t0.05，和第 0 天相比，3 個平均值間的差異均無統計學意義。小樣的穩定性試驗結果顯示，在4 ℃和室溫條件保存90 d，樣品穩定性符合要求，運輸穩定性通過37 ℃、72 h 的極端挑戰，符合要求。正式樣品 t0.05＝2.02，計算 t37℃，144h＝ 0.47，t45℃，97h＝ 0.42，均小于 t0.05，和第 0 天相比，2 個平均值間的差異均無統計學意義。正式樣品的穩定性試驗結果顯示，運輸穩定性通過 37 ℃ 、144 h 和 45 ℃ 、97 h 的極端模擬挑戰，也符合要求，可保證偏遠地區樣品運輸的穩定性。

表4 小樣 t 檢驗結果Tab.4 t－ test results of small samples

表5 正式樣品 t 檢驗結果Tab.5 t－test results of formal samples

2.3 能力驗證統計結果

本次能力驗證共152 個實驗室報名參加，食藥監系統有1 個實驗室中途退出，3 個實驗室在規定時限內未提交檢測結果，最終148 個實驗室在規定時限內提交了檢測結果。計算剔除離群值的數據對數中位值為2.79，按照結果評價的原則，結果對數值滿意范圍為2.29 ～3.29；報告值滿意范圍為195 ～1 950 cfu／g。按結果評價的原則，未提交檢測結果的3 家機構的實驗室直接判定為不滿意。上報的148 個實驗室檢測結果中，141 個為滿意，7 個為不滿意，整體滿意率為 93.38% （141 ／ 151）。結果按單位屬性統計，食藥監系統滿意率為96.88%（91 ／94），企業滿意率為 87.04% （47 ／54），科研院所滿意 率 為 100.00% （1 ／1），檢 驗 檢 測 機 構 滿 意 率 為100.00% （2 ／2）。

2.4 不滿意結果原因分析

本次能力驗證共152 個實驗室報名參加，1 個實驗室中途退出，3 個實驗室在規定時限內未提交檢測結果，原因為：實驗室檢驗檢測能力正在建設調整；收樣后未開展工作；自身原因。

上報的148 個實驗室檢測結果中，7 個結果不滿意，結合平臺提交結果和原始記錄分析，原因為：操作人員原始記錄正確，平臺上報結果產生錯誤（5 個）；實驗人員培訓不足致試驗中斷（1 個）；檢測結果溢出（1 個）。

3 討論

通過考察樣品的均勻性和穩定性可見，本次能力驗證的樣品均勻、穩定；通過回收數據可見，未發現質量問題和破損問題，表明樣品穩定性好。本次能力驗證中，樣品均勻性和穩定性考察、統計設計、數據分析、結果評價等環節均符合《能力驗證提供者認可準則在微生物領域的應用說明》（CNAS － CL03 － A001，以下簡稱《說明》）［15］。該《說明》中，微生物水平較高的定量計劃，可將參加者結果轉換為以10 為底的對數值，通過計算統計量［ Z 值、臨界值（CD 值）、中位值 ± 0.5］來評定參加者的能力。本次能力驗證活動中選擇了以對數中位值±0.5 進行評定。同時，此評價標準也符合2015 年版《中國藥典》要求，即微生物計數同一供試品重復性允許誤差為2 次測定結果對數值之差不超過0.3，重復性允許誤差為2 次測定結果對數值之差不超過 0.5［16］。

實驗室質量管理工作分為人員、培養基、試劑、菌種、環境、設備、樣品、檢測方法、污染廢棄物處理、檢測結果質量保證和檢測過程質量控制、實驗記錄、結果判斷和檢測報告、文件共13 個要素，2015 年版《中國藥典（四部）》9203 章節《藥品微生物實驗室質量管理指導原則》中有詳細描述［2］。通過本次能力驗證，全面考察了其中11 個要素（除菌種和污染廢棄物處理）。回收的148個實驗室檢測結果中，實際僅有1 個數據溢出，說明參與單位藥品需氧菌總數測試能力整體達到優秀水平。可見，人員是影響微生物檢驗檢測結果的重要因素，回收的148 個實驗室的檢測結果中，6 個不滿意結果均為人員操作失誤導致，且上述提到的1 個數據溢出可能也與操作人員能力和經驗不足有關。說明需要不斷提高人員的操作能力，加強相關培訓，不斷提高檢驗檢測標準和能力建設要求。

需要指出的是，以上結果均在對數中位值±0.5 的統計值評定下得到。本次能力驗證為藥品微生物檢驗檢測領域內首次開展全國范圍內的定量能力驗證，在組織和統計上存在缺乏經驗指引的不足，統計指標選擇較初級。如果選用微生物國際能力驗證中最常采用的 Z 值，以對數中位值為指定值（X），以標準化四分位距為能力評定標準差（σ）作為統計值。即｜Z ｜≤2.0 為滿意，2.0 ＜｜Z ｜＜ 3.0 為有問題，｜Z ｜≥3.0 為不滿意，以此評定準則來進行評定。整體滿意率為 93.38%（141／151），如按上述標準，142 個實驗結果（148 個返回結果，去除人員操作失誤的6 個結果）中，有7 家機構的試驗結果不滿意，有6 家機構的試驗結果可疑。最終結果滿意率下降為85.43%（129／151），從側面反映本次能力驗證方案中統計設計相對簡單。

本次能力驗證方案設計中還存在其他不足和需要提高的地方，如數據防竄通不夠、尚未體現藥品計數方法驗證的特點。今后的工作中將不斷完善和改進藥品微生物檢驗檢測能力驗證計劃，進一步提升藥品微生物檢驗檢測工作的水平和能力。