益生菌對脂多糖誘發大鼠腦內神經炎癥及認知功能障礙保護作用的實驗研究

李正民，李江靜，莊瑩瑩，閆 輝，劉偉娜，屈麗虹

(空軍軍醫大學唐都醫院麻醉科，陜西 西安 710038)

神經退行性變目前已成為我國老年人群中主要的致殘致死原因之一，包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病等在內的疾病，由于其發病機制不明，目前尚無治愈這些疾病的藥物，因此神經退行性病的發病機制和治療靶點一直是國內外學者的研究熱點之一。已有研究證實神經退行性變其本質是神經慢性炎癥，從炎癥入手或許是可以解開神經退行性病的一把鑰匙。AD俗稱老年性癡呆或認知障礙，是老年人常見的中樞神經系統退行性疾病[1]。在動物模型中的一項實驗研究表明，細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)注射到大腦的第四腦室中，可以重現AD中的許多炎癥和病理特征[2]，而且又有研究表明腹腔注射LPS可引起小鼠海馬區域淀粉樣β蛋白沉積進而導致小鼠認知功能障礙[3]，因此腹腔注射LPS可模擬AD樣病理改變，是一種可用于研究AD相關的神經炎癥和隨后神經功能障礙合適的動物模型[4-5]。

近年來，越來越多的研究表明，人類共生微生物是影響宿主健康的重要環境因素。大約95%的共生微生物位于腸道，它們在人類營養、消化、神經營養、炎癥、生長、免疫和抵御病原體感染方面發揮著重要作用[3]。在眾多的腸道微生物中，乳酸菌、雙歧桿菌和腸球菌已被證明可以通過改善腸道微生物平衡而對宿主產生有益的影響，因此被歸類為益生菌[4]。本實驗通過腹腔注射LPS模擬神經炎癥[4-5]，利用口服益生菌的干預方式，觀察益生菌是否對LPS所致的認知障礙起保護作用，是否會減輕神經炎癥的產生，為神經炎癥以及神經退行性病變的防治研究提供進一步實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康成年雄性SD大鼠共32只，體重220～250 g，購自第四軍醫大學動物中心，自由飲食，12 h明暗循環。

1.1.2 主要儀器與試劑：水迷宮視頻分析系統WMT-1005(成都泰盟)，酶標儀(Bio-Rad)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、一氧化氮合酶(iNOS)酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。益生菌(LACTIBIANE,Store Houses,B.V.)，脂多糖(Sigma)，兔抗BDNF單克隆抗體(Abcam)，小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Abcam)，GE9612T-S基因擴增儀(杭州柏恒科技有限公司)，Line Gene 9640 熒光定量 PCR 儀(杭州博日科技有限公司)。總RNA 抽提純化試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，Real Time PCR 反轉錄試劑盒(TAKARA)， 實時熒光定量 PCR 反應試劑盒(TAKARA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗模型和分組：將大鼠隨機分為四組，每組8只。對照組：大鼠灌胃2 ml生理鹽水，連續3周。LPS組：大鼠灌胃2 ml生理鹽水連續3周，自第3周開始，生理鹽水灌胃處理后腹腔注射LPS，劑量為250 μg/(kg·d)，連續1周。LPS+益生菌組：將乳酸桿菌(Lactobacillus)溶于生理鹽水中，制備成濃度為5×107CFU/ml 的益生菌懸液，取2 ml益生菌懸液灌胃，即108CFU/d，連續3周灌胃給藥，自第3周開始益生菌懸液灌胃處理后腹腔注射LPS，劑量為250 μg/(kg·d)，連續1周。益生菌組：取2 ml益生菌懸液灌胃，即108CFU/d，連續3周灌胃給藥，觀察該益生菌懸液對健康成年大鼠神經系統及認知功能是否有影響。

1.2.2 行為學實驗方法：開始LPS腹腔注射的第2天即開始水迷宮學習行為訓練。水迷宮采用直徑為1.5 m、高為0.5 m的圓形的黑色水池，并且在水池壁內測貼有不同顏色、不同形狀的圖案作為標志。開始訓練時，在池中加入黑色墨水，使水不透明，水溫保持(25±1)℃。調節合適的實驗室亮度，保持實驗室周圍環境安靜舒適。在某一象限內放置一個直徑約為10 cm的有機玻璃平臺，置于水面下約1 cm。水迷宮行為學實驗分為兩個階段，即訓練學習階段和測試階段。訓練學習階段為期5 d，每天將每組大鼠(n=8)從四個象限設定好的位置分別放入水中，直到大鼠找到水下的平臺，并在平臺上保持停留15 s，如果大鼠在60 s內未找到平臺，實驗員應將其引導至平臺上并停留15 s。行為學訓練后第6天為測試階段，移去水下的平臺，觀察大鼠60 s內通過平臺所在區域的次數及首次達臺時間。所有實驗都通過攝像頭錄像，并通過電腦圖像分析軟件進行分析。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA):接受行為學測試后的大鼠立即麻醉，斷頭，取出大腦組織，并分離出大腦皮層組織，立即置于液氮速凍后放于-80 ℃冰箱保存。之后取出冷凍大腦皮層組織，在低溫環境下進行組織勻漿，離心后取上清液，用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的水平。先制備標準品(倍比稀釋，濃度參照說明書)，隨后按序依次加樣，設立標準孔、空白孔、待測樣品孔，100 μl/孔，輕晃混勻，37 ℃孵育90 min，之后加入生物素化抗體工作液(1∶100)，100 μl/孔，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入酶結合物工作液(1∶100)，100 μl/孔，37 ℃孵育30 min，洗板5次，加入底物溶液，90 μl/孔，37 ℃避光孵育15 min左右，加入終止液50 μl/孔，570 nm波長測OD值，計算濃度。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot):從-80 ℃冰箱取出已經冷凍的皮層額葉組織低溫下勻漿提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，沸水煮10 min待用。各組取樣品30 μg，以樣品中的GAPDH作為內參，經SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，然后用5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h，根據各蛋白分子量不同，將膜剪裁開，分別放入按比例配制好的一抗中(兔抗BDNF單克隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體)，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。TBST洗膜5次，每次5 min，分別放入對應二抗中，室溫孵育1 h。洗膜5次，每次5 min，之后化學發光發熒光顯色。

1.2.5 聚合酶鏈反應(PCR) :將動物注射麻醉后,處死,取出腦組織,剪碎浸入5～10倍體積的RNA GUARD液中并置入4 ℃冰箱過夜后移入-20 ℃冰箱中保存備用。注意此步驟動作一定要非常迅速,以盡可能避免組織中的降解。按照步驟依次提取組織總RNA，合成cDNA第一鏈及進行擴增。PCR擴增反應條件為：將反應體系混勻后短暫離心混勻，反應液于94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；完成40個循環后72 ℃充分延伸5 min。委托上海英駿生物技術有限公司設計與合成引物：腦源性神經營養因子(BDNF)-F(bp577):5’-CTGGAGAAACTCCCGGTATC-3’,BDNF-R(bp711c):5’-GGTAGTTCGGCATTGCGAGT-3’。

2 結 果

2.1 各組LPS導致的認知功能障礙比較 在水迷宮定位航行試驗中訓練第1天時，LPS組大鼠潛伏期長于對照組大鼠，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。大鼠在水迷宮訓練至第5天時，LPS+益生菌組大鼠潛伏期短于LPS組大鼠，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)。水迷宮空間探索實驗結果顯示：與對照組相比，LPS組大鼠首次達臺時間延長，穿越平臺次數減少，差異有統計學意義(P<0.05)，而LPS+益生菌組大鼠與LPS組大鼠相比，LPS+益生菌組大鼠首次達臺時間縮短，穿越平臺次數增多，差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

A:各實驗組大鼠水迷宮定位航行實驗中訓練潛伏期統計結果；B:各實驗組大鼠水迷宮空間探索實驗中首次達臺時間與穿越平臺次數統計結果

2.2 各組大鼠大腦皮層組織促炎因子水平比較 ELISA實驗結果顯示：與對照組相比，LPS組大鼠大腦皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS水平升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，而LPS+益生菌組與LPS組相比，TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS水平降低，差異有統計學意義(均P<0.05),見表1(圖2)。

表1 各組大鼠大腦皮層組織促炎因子水平比較

注：與對照組相比，#P<0.05；與LPS組相比，*P<0.05

2.3 各組大鼠大腦皮層BDNF表達水平比較 與對照組相比，LPS組大鼠大腦皮層組織BDNF表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而LPS+益生菌組與LPS組相比，BDNF表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；qt-PCR結果與Western blot結果一致,見表2(圖3)。

表2 各組大鼠大腦皮層BDNF表達水平比較

A:大鼠大腦皮層對BDNF的表達Western blot及統計結果；B:大鼠大腦皮層對BDNF的qt-PCR結果統計。與對照組相比,#P<0.05；與LPS組相比,*P<0.05

3 討 論

本研究聚焦于益生菌對LPS所致大鼠神經炎癥及認知功能的影響，實驗結果顯示，腹腔注射LPS導致大鼠學習記憶能力下降，表現出認知功能障礙，而益生菌可以改善LPS所致的大鼠認知功能障礙，提高其空間學習記憶能力，并且降低LPS所致大鼠大腦皮層組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的表達，升高BDNF的表達，減輕神經炎癥反應[6-7]。

有證據表明腸道微生物群與中樞神經系統(CNS)之間存在雙向聯系，存在腸-腦軸[8]。事實上，腸道菌群組成的改變可能在一些神經系統疾病的發病機制中起關鍵作用[9]。在這一方面，益生菌的使用是一個有趣、可行的方法平衡腸道菌群的組成，從而對宿主健康產生有益的影響[10]。大量研究表明，含益生菌的口服細菌療法對各種神經系統疾病有多種益處。近期，也有報道稱益生菌補充乳酸菌和雙歧桿菌通過抗炎、抗氧化和神經保護作用對神經退行性疾病有積極的影響[11]。已有研究表明，LPS可激活中樞神經系統中toll樣受體4 (TLR4)信號，該信號與神經膠質細胞和各種神經炎癥介質的激活有關，最終導致神經元凋亡[12]。神經炎癥與認知障礙和記憶衰退有關，因為在炎癥期間，海馬體更容易在突觸傳遞和可塑性方面發生變化[13]。已有研究結果證實了益生菌的有益作用，增強腸上皮完整性，保護屏障不受破壞，減少促炎反應，抑制神經炎癥和神經變性的起始或增殖。例如,它已被證明無論在體外還是在大腦中，腸球菌都有效，乳桿菌減少TNF-α生產和補充這些益生菌菌株在動物實驗中減少氧化應激和誘導抗氧化酶的產生[14]。本研究實驗結果也證實了上述觀點。

BDNF是表達最廣泛、研究最密切的神經營養因子之一，在結構上與神經生長因子、神經營養因子-3和神經營養因子-4相關，調節特定神經元群體的生存能力和功能完整性[15]。BDNF參與中樞神經系統內的多種功能，包括神經元存活和分化[16]，而BDNF水平的變化可能通過突觸傳遞功能障礙和可塑性導致認知缺陷，導致精神分裂癥相關的化學和結構失衡[17]。與對照組相比，小鼠海馬特異性缺失BDNF會導致新的物體識別和空間學習障礙[18]。在水迷宮中測試時，發現BDNF基因單拷貝缺失小鼠的學習能力明顯受損，需要的訓練時間是野生型小鼠的兩倍。本文實驗結果發現LPS導致大鼠腦內BDNF表達下降，而口服益生菌可增加BDNF的表達。而已經有學者認為益生元和益生菌作為認知障礙的潛在治療方法[19]，因為腸道微生物群可以通過改變神經遞質的功能來調節中樞神經系統中的BDNF功能，比如通過影響kynurenine通路等調節機制，或者通過改變大腦中的短鏈脂肪酸(SCFAs)的可用性和作用[15]。

有學者提出飲食干預是改變腸道菌群最有效的方法之一[20]，基于我們的研究結果，益生菌因其有效的抑炎作用可以作為神經炎癥及神經退行性疾病的防治方法之一，并且其抑炎作用確實改善了LPS引起的認知功能障礙。綜上所述，益生菌可以通過抑制炎癥反應而對LPS誘發大鼠認知功能障礙起到保護作用。這一結論為益生菌對神經炎癥的防治提供了進一步的實驗基礎，為進一步探索益生菌抑炎作用提供了方向。