基于網絡藥理學研究健脾固腸方治療結腸癌的作用機制＊

陳中怡，李 蕓，周張杰，吳婷婷，付淑娟，鐘 薏＊＊，楊 銘，陳 健，王治英

（1.上海市虹口區歐陽路街道社區衛生服務中心 上海 200081；2.上海中醫藥大學研究生院 上海 201203；3.上海市中西醫結合醫院 上海 200082；4.上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 200032；5.天津中醫藥大學中醫學院 天津 301617）

結腸癌是是常見的惡性腫瘤之一。2018年的全球癌癥數據報告[1]顯示，結腸癌已成為發病率前三的癌癥之一，其死亡率排名第二。由于基因表達模式多變，很多調控機制尚有待研究，西醫并未明確結腸癌的發病機制。目前已有三種學說：腺瘤-癌變學說、腫瘤干細胞假說和炎癥學說。對于未轉移的結腸癌，主要通過外科手術治療；無法手術的則采用內科放化療或放化療結合手術治療、基因治療、分子靶向藥物治療、生物免疫學治療等。但西醫治療仍有一定局限性，許多患者無法耐受在療效收益同時帶來的不良反應。

中醫古籍中并未確切提到結腸癌這一名詞，但在古籍中能找到大量與現代大腸癌癥狀體征、病因病機類似的病名，早在《黃帝內經》中就有相關記載，如《靈樞·刺節真邪篇》中云： “有所結，氣歸之，衛氣留之，不得反，津液久留，合而為腸溜” 。現代將大腸癌歸屬于中 醫 “便血” “腸風” “積聚” “臟毒” “腸蕈” “鎖肛 痔” 等范疇。現代中醫在古人的基礎上，在治療結腸癌以及改善結腸癌伴有的便秘、腹瀉、腹痛、便血等癥狀上取得了長足發展，提高了患者的生存質量。祖國傳統醫學治療結腸癌的寶庫亟待發掘。

健脾固腸方是上海市中西醫結合醫院鐘薏主任在臨床治療結腸癌中總結出的經驗方。健脾固腸方的 “前身” 扶正健脾方已經通過動物實驗證實能夠降低PI3K、AKT蛋白的表達，抑制PI3K-AKT信號通路，從而減少腸癌侵襲及轉移微環境的形成，減少結腸癌復發及轉移的可能性[2]。前期關于健脾固腸方的臨床研究和動物實驗已經證實，健脾固腸方能夠減少腸道粘膜通透性、抑制腸道炎性反應[3]、保護腸道屏障[4]、調節腸道免疫平衡[5]，能改善結腸癌引起的不適主訴，減少結腸癌的轉移及復發，提高結腸癌患者的長期生活質量。

由于健脾固腸方組成藥物多、成分復雜，其治療結腸癌的作用機制尚不完全明確。而網絡藥理學是一門通過設立信號節點搭建網絡，進一步分析網絡闡述疾病過程與藥物對機體作用，從而研究藥物作用機制的新興學科。近年來網絡藥理學在篩選中藥活性化合物、預測中藥作用靶點、闡述方藥作用機制等中醫藥研究中起著重要作用。

本研究通過網絡藥理學研究，嘗試探討健脾固腸方治療結腸癌的作用機制。PI3K是健脾固腸方的前身扶正健脾方的作用靶點，同時是PI3K-AKT信號通路的上游，且前期發現能夠能減輕腸道炎癥[3]，故通過體外實驗研究驗證健脾固腸方及其關聯度最高的潛在活性化合物棕櫚酸對PI3K、AKT蛋白與IL-6炎性因子的影響，為健脾固腸方的臨床應用、新適應癥開發以及治療結腸癌的新藥研發提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學部分

1.1.1 篩選活性成分和靶蛋白

本研究通過檢索CINTMED、TCMID、TCMSP、HIT、STITCH數據庫，以QED大于0.2[6]作為篩選原則，通過TCMSP、PubChem、ChEMBL數據庫以及查閱相關文獻得到化合物的化學結構。

通過TCMID、TCMSP、HIT、STITCH數據庫進行活性化合物的靶點預測。TCMID、HIT以RV大于0.8作為篩選指標，TCMSP以RFA大于0.8、AVM大于0.7作為篩選指標，STITCH以Medium confidence 0.400作為篩選指標[7]。

1.1.2 結腸癌的相關靶點搜集

通過檢索MalaCards、HGMD、OMIM、TTD、DrugBank以及查閱相關文獻，整理得到結腸癌的疾病靶點數據庫。

1.1.3 中藥-化合物-靶點-疾病網絡構建

將復方潛在作用靶點和結腸癌靶點信息分別導入STRING構建PPIN。并利用Cytoscape 3.7.2[8]建立健脾固腸方中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖。

1.1.4 構建靶點相互作用網絡

通過Network Analyzer對其進行網絡分析，先以Degree的2倍中位數篩選出核心網絡，再根據Degree中位數、Closeness中位數、Betweenness中位數篩選出結腸癌關鍵靶點相互作用網絡[9]，再利用Merge將兩者合并，篩選出健脾固腸方結腸癌共同關鍵靶點相互作用網絡。

1.1.5 KEGG信號通路和GO生物過程富集分析

將采集篩選得到的健脾固腸方潛在作用靶點分別導入GO、KEGG數據庫，采用超幾何分布模型P值評估GeneSet與基因本體是否顯著關聯，并使用Bonferroni Corrected[10]調整的P值（P.adjust）反映靶點與基因本體的關聯強度，以P.adjust<0.01為顯著關聯，得到GO富集及KEGG信號通路。

1.2 實驗部分

1.2.1 藥物制備與試劑

健脾固腸方顆粒劑（江陰天江藥業有限公司，批號：1709320）；棕櫚酸（Sigma，批號：SLBM8964N）；氫氧化鈉（Richjoint，批號：20190310JN）；脫脂牛血清白蛋 白（Bio-Light Biotech，批 號：BSA081022）；PBS（Basal Media，批號：C210702764）；0.4%臺盼藍染液（Noblebio，批號：2019070500）；DMEM培養基（Giboc，批號：2120374）；胎牛血清FBS（Giboc，批號：1828728）；CCK8試劑盒（Sangon Biotech，批號：E606335-0500）；EDTA胰酶（Giboc，批號：25200-072）；PI3 Kinase p110βRabbit mAb（CST，批 號：3011S）；Phospho-PI3 Kinase ClassⅢ（Ser249）Antibody（CST，批號：13857S）；Goat Anti-Rabbit IgG二抗HRP（Abbkine，批號：A21020）；Goat Anti-Mouse IgG（Abbkine，批 號：A21010）；Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（Abbkine，批號：A01010）等。

將10只SD大鼠隨機分成空白組和中藥組，空白組2只，中藥組8只。中藥組按相當于70 kg成年人105 g中藥的劑量，即9.45 g·kg-1劑量對大鼠灌胃，空白組大鼠按重量灌胃等體積的超純水，每天灌胃1次，連續灌胃10日。在第10日灌胃后2 h，對大鼠進行心臟取血，以4℃、2000 rpm離心10 min后提取血清，除菌后以-80℃冷凍存放。所有SD大鼠購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006，合格證編號：20180006008347，飼養于上海市中西醫結合醫院脈管病研究所。

1.2.2 分組和藥物干預

分為健脾固腸方含藥血清組、空白血清組和棕櫚酸組。含藥血清組和空白血清組分別再設20%組、15%組、10%組和5%組[11]。棕櫚酸組再設500μM組、250μM組、125μM組、62.5μM組、31.25μM組、15.63 μM組、7.81μM組、3.91μM組、1.95μM組和0μM組[12]，并另設對照組和空白對照組。

1.2.3 細胞培養傳代

SW480細胞由上海中醫藥大學科技實驗中心分子生物與藥理實驗室吳中華老師惠贈。將細胞懸液加入10 cm皿中，同時加入8 mL培養基培養過夜，直至檢測細胞密度達到80%時進行傳代培養。

1.2.4 CCK8法

在96孔板上以每孔5×103個細胞接種，設4個復孔，按照2.4分組和藥物進行干預。在每個復孔中加入10μLCCK8試劑，將孔板放入培養箱中孵育45 min，用酶標儀在450 nm波長處測定光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Western Blot法

測定蛋白濃度并計算蛋白上樣量。將蛋白樣品分別加入10%和5%的凝膠中電泳，轉膜，5%脫脂牛奶于室溫條件下搖床封閉2 h，按照1∶1000加入一抗，4℃孵育過夜。第2日1×TBST充分洗膜（5 min×3），加入二抗（1∶2000），1×TBST充分洗膜（5 min×3），ECL發光顯影。

1.2.6 化學發光法

收集細胞上清液，將上清液和生物素標記抗體，三聯吡啶釕標記抗體加入一次性反應杯，37℃孵育10 min。加入聯袂親和素包被的磁珠，37℃孵育10 min。加入三丙胺激發緩沖液，檢測相對光子強度（Relative light units，RLU）。通過標準品的RLU簡歷標準曲線，定量測出IL-6的含量。

1.2.7 統計學方法

采用SPSS 27.0軟件進行單因素方差分析，當Levene方差齊性檢驗顯示方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較，以P值小于0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學部分

2.1.1 健脾固腸方候選化合物和對應人類靶點篩選結果

健脾固腸方8味中藥中，黃芪有36個活性化合物，黨參有30個活性化合物，茯苓有7個活性化合物，白術21個活性化合物，土茯苓有20個活性化合物，菝葜有13個活性化合物，預知子有3個活性化合物，藤梨根有2個活性化合物，共有102個潛在活性化合物，30個活性化合物在不同中藥中重疊。通過Network Analyzer對其進行網絡分析，表1展示了結果中Degree值大于1的部分，通過分析可得全方關聯最多潛在活性化合物為棕櫚酸（palmitic acid，c175）。

表1 健脾固腸方中藥-活性化合物網絡分析及其拓撲學特征

2.1.2 構建中藥-活性化合物-潛在作用靶點網絡及蛋白質互相作用網絡

健脾固腸方共得到潛在作用靶點481個，將結果導入Cytoscape 3.7.2通過Network Analyzer對其進行網絡分析，篩選出關鍵節點51個（表2、圖1）。

表2 健脾固腸方關鍵靶點及其拓撲學特征

2.1.3 人結腸癌蛋白質互相作用網絡

共篩選出572個結腸癌疾病靶點，去重合并整理后共得到517個疾病靶點（圖2）。將結果導入Cytoscape 3.7.2通過Network Analyzer對其進行網絡分析，篩選出關鍵節點25個（表3）。

表3 結腸癌關鍵靶點

圖2 結腸癌靶點互相作用網絡

2.1.4 健脾固腸方-結腸癌互相作用網絡

建立復方-疾病共同PPIN（圖3）。利用Cytoscape 3.7.2中Merge得到疾病與復方4個共同關鍵靶點（表4）。

圖3 結腸癌與健脾固腸方靶點互相作用網絡

表4 結腸癌與健脾固腸方共同關鍵靶點

2.1.5 GO富集分析

共富集得到基于MF 153條疾病GO途徑和176條復方GO途徑，基于BP 2479條疾病GO途徑（圖4）和2318條復方GO途徑（圖5），基于CC 82條疾病GO途徑和98條復方GO途徑（圖6）。綜合GO富集分析顯示，健脾固腸方潛在作用靶點和疾病靶點在GO水平上顯示出共關聯性，復方與疾病基因共關聯GO相似度達61.57%，主要與細胞的增殖、分化和凋亡、轉錄、信號轉導、跨膜運輸等有關。

2.1.6 KEGG信號通路富集分析

分析得到復方與疾病共關聯信號通路54條（圖7），其中PI3K-AKT信號通路（圖8）、腫瘤壞死因子信號通路（圖9）、細胞凋亡（圖10）與3個共關聯靶點有關。復方與疾病基因共關聯KEGG信號通路相似度72.00%。

圖9 腫瘤壞死因子信號通路

圖10 細胞凋亡

2.2 實驗部分

2.2.1 健脾固腸方含藥血清及棕櫚酸對SW480細胞增殖的影響

研究結果表明，健脾固腸方含藥血清干預24 h，在5%低濃度范圍時，能夠促進SW480細胞增殖（圖11）；在10%到20%較高濃度范圍時，能夠抑制SW480細胞增殖，且呈濃度依賴性，通過單因素方差分析比較不同濃度含藥血清與同濃度空白血清OD值發現（圖12），15%濃度含藥血清與同濃度的空白血清相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；20%濃度含藥血清與同濃度的空白血清相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。

圖12 不同濃度含藥血清、空白血清、培養基干預24 h的OD值

研究結果表（圖13-圖14）明，棕櫚酸干預24 h，在0μM-62.5μM低濃度范圍內能夠促進SW480細胞增殖；在125μM-500μM高濃度范圍內能夠抑制SW480細胞增殖。棕櫚酸干預48 h，在0μM-62.5μM低濃度范圍內同樣能夠促進SW480細胞增殖，在125μM-500μM高濃度范圍內能夠抑制SW480細胞增殖。

圖13 不同濃度棕櫚酸分別干預24 h、48 h對SW480細胞的抑制率

圖14 不同濃度棕櫚酸分別干預24 h、48 h的OD值

2.2.2 健脾固腸方含藥血清和棕櫚酸干預SW480細胞后PI3K和AKT蛋白的表達

研究結果表明（圖15-圖16），與對照組相比，含藥血清組和棕櫚酸組能降低SW480細胞中PI3K的蛋白表達，但與對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）；空白血清組中PI3K蛋白表達升高，但與對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。與空白血清組相比，含藥血清組能降低PI3K蛋白的磷酸化，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低PI3K蛋白的磷酸化，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖15 各組藥物干預24 h對SW480細胞中PI3K蛋白的表達

圖16 各組藥物干預24 h對SW480細胞中p-PI3K蛋白的表達

研究結果表明（圖17），與空白血清組相比，含藥血清組能降低AKT總蛋白的表達，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低AKT總蛋白的表達，差異有統計學意義（P<0.01）。與空白血清組相比，含藥血清組能降低AKT蛋白的磷酸化，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能降低AKT蛋白的磷酸化，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖17 各組藥物干預24 h對SW480細胞中AKT、p-AKT蛋白的表達

2.2.3 健脾固腸方含藥血清和棕櫚酸干預SW480細胞后對IL-6含量的影響

研究結果表明（圖18），與空白血清組相比，含藥血清組能降低SW480細胞中IL-6濃度，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，含藥血清組能升高IL-6濃度，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，棕櫚酸組能升高SW480細胞中IL-6濃度，差異有統計學意義（P<0.01）；與對照組相比，空白血清組中IL-6濃度升高，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖18 各組藥物干預24 h SW480細胞中IL-6的濃度

3 討論

結腸癌臨床表現通常有便秘、腹瀉、腹痛、腹脹、不思飲食、惡心嘔吐、精神倦怠、寡言少語等，通過大量臨床病例的經驗總結，以四君子湯為基礎，擬出的健脾固腸方[13]，全方共黃芪、黨參、茯苓、白術、土茯苓、菝葜、預知子、藤梨根8味藥。全方以黃芪補氣益衛、固表止汗、托瘡生肌、利水消腫，能夠促進腸道粘膜修復、減輕腸道炎癥反應[14]，黨參、茯苓、白術共同作用，加強補益脾胃正氣，健脾和胃，減少對腸道粘膜的刺激，修復腸道粘膜的損傷[15-17]，土茯苓、菝葜、藤梨根化濕解毒[18-20]，預知子疏肝理氣、和胃調中、活血化瘀、軟堅散結、抑癌扶正[21]。健脾固腸方全方用藥平和，溫涼兼備、補瀉兼施，補以補氣健脾，瀉以化濕化瘀，補中有瀉，瀉中有補，調和陰陽。前期臨床研究已經表明，健脾固腸方能夠通過抑制腸道粘膜通透性、腸道炎性反應，達到保護腸道屏障、調節機體免疫的功能，還能改善結腸癌引起的不適主訴，減少結腸癌轉移或者復發的幾率，提高結腸癌患病后的長期生活質量[4]。

通過Cytoscape 3.7.2軟件分析健脾固腸方藥物-活性化合物-靶點網絡，得到健脾固腸方8味中藥按網絡中心性高低排序依次為黃芪、黨參、白術、土茯苓、菝葜，基本符合君臣佐使的配伍原則，茯苓的網絡中心度結果與其作為臣藥的配伍規律不盡相符，可能需要今后進一步試驗研究加以明確。

通過Cytoscape 3.7.2軟件分析出健脾固腸方關聯性最高的活性化合物為棕櫚酸（palmitic acid，c175），可能是健脾固腸方治療結腸癌最重要的物質基礎，主要來自黃芪、黨參、白術，表明黃芪、黨參、白術在該方中具有不可撼動的地位。同時土茯苓、預知子、茯苓、菝葜、黨參、黃芪、白術7味中藥中均有棕櫚酸，探索有效成分可以為進一步研究健脾固腸方的作用療效提供新的方法，并且為優化方劑、開發新藥提供方向。

通過PPIN分析，健脾固腸方關鍵靶點51個，結腸癌關鍵靶點25個，健脾固腸方與結腸癌共同關鍵靶點4個，分別為TP53、TNF、AKT1、IL6，棕櫚酸對4個靶點均有作用。健脾固腸方活性化合物可能通過上調TP53表達，下調TNF、AKT1、IL-6表達達到治療結腸癌的作用。

本次研究以人結腸癌SW480細胞為研究對象，采用CCK8法探討健脾固腸方含藥血清和有效單體棕櫚酸對SW480細胞的增殖作用，實驗結果驗證了含藥血清和棕櫚酸在不同濃度下對人結腸癌細胞有增殖和抑制兩種相反作用，濃度決定了作用的傾向性。中藥中有效成分的濃度高低影響細胞生物學行為，如關于經方血府逐瘀湯的研究表明，低濃度（<10%）含藥血清能促進大鼠主動脈平滑肌細胞增殖和遷移、侵襲，反之高濃度（>10%）含藥血清則有抑制作用，其作用可能與上清液的NO含量水平有關[22]。健脾固腸方含藥血清也表現了相同的趨勢，在低濃度時有促進腫瘤細胞增殖的作用，而在高濃度時具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，可能與血清中的含藥成分濃度高低有關。而低濃度棕櫚酸對腫瘤有促進作用，高濃度對腫瘤有抑制作用，與文獻查閱結果基本一致[23-26]。作用傾向取決于濃度的現象，可能提示了臨床上健脾固腸方宜濃煎服用。

由于健脾固腸方前身 “扶正健脾方” 能顯著抑制PI3K和AKT的表達，故此次選擇PI3K和AKT作為靶蛋白驗證。在選擇抑制腫瘤細胞增殖的半抑制濃度后，發現含藥血清和棕櫚酸都降低SW480細胞中PI3K蛋白和AKT蛋白的磷酸化表達，結腸癌是一種由多因素導致、多基因參與、多階段發生的疾病，結腸腫瘤細胞的活動與信號通路中蛋白質異常磷酸化有關[27]。

在選擇抑制腫瘤細胞增殖的半抑制濃度后，發現空白血清、含藥血清及棕櫚酸均能升高SW480細胞中IL-6的濃度。考慮原因可能是大鼠血清和人結腸癌SW480細胞為異體血清，誘發了炎癥反應，導致IL-6濃度升高；含藥血清較空白血清能降低IL-6濃度，說明健脾固腸方可能通過下調IL-6濃度，抑制PI3KAKT信號通路，從而減少腫瘤細胞的轉移與侵襲[28]；棕櫚酸較空白血清能升高IL-6濃度的原因尚不明確，初步考慮可能與高脂環境誘發細胞炎癥以及IL-6具有雙向調節作用有關[29]，今后將進一步研究。此外，健脾固腸方中黨參、茯苓、白術、土茯苓、菝葜都對醇溶性浸出物有檢測要求，今后可進一步行質譜分析了解復方中棕櫚酸及其催化反應中間產物、代謝產物的含量。