黃驊特產皮皮蝦蝦殼中甲殼素的制備研究

陳依淼， 許召旭，司星雨，牛亞男，秦征帆，史興辰，姜寶杰*

（1.河北農業大學理工系，河北 滄州 061100；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

甲殼素，又名甲殼質、幾丁質，是一種由β-1，4 糖苷鍵連結的天然高分子線性化合物[1]，主要存在于昆蟲的外殼、甲殼類動物的骨骼和外殼中[2]。 蝦、蟹等水產品的廢棄物[3-5]是甲殼素的主要制備原料。 近年來，隨著研究的深入，甲殼素被廣泛應用于食品、醫藥衛生、農業、工業織染等領域[6-7]。

目前，制備甲殼素常見的方法有酸堿法、微生物發酵法、酶解法和預處理法[8-11]等，工業上制備甲殼素的主要方法是酸堿法[2]，對環境污染較大。 基于此現狀，國內外把甲殼素的制備方法轉向生物制備， 其中發展相對成熟的是微生物發酵法和酶解法[12-13]，酶解法與化學法相結合的方法較少[14-16]。

皮皮蝦是河北省黃驊市的特產之一， 具有很高的食用價值和產品附加值[17]，但由于深加工工藝不夠完善，導致產品附加值較低，存在原料浪費情況嚴重等問題。 采用中性蛋白酶去除蛋白質結合醋酸脫鈣的方法處理黃驊特產皮皮蝦蝦殼， 對蝦殼中甲殼素的制備工藝進行探索，提高甲殼素得率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

黃驊特產皮皮蝦：市售；中性蛋白酶（50 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；醋酸：天津科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸銅、乙二胺四乙酸二鈉：天津市北辰方正試劑廠；碳酸鈣：天津市光復精細化工研究所；硫化鈉、檸檬酸鈉：天津市化學試劑三廠；氫氧化鉀：天津市致遠化學試劑有限公司；鈣紅指示劑、鹽酸、乙醇：天津東麗區天大化學試劑公司。 以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

萬能粉碎機（HX-300A）：永康藥具廠；高速冷凍離心機（HG-3018R）：安徽中科中佳科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DKT200-1）：北京中興偉業儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（SD101-1DB）、電子分析天平（FA2204B）、可見分光光度計（722VIS-722）：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦殼預處理

皮皮蝦水煮后剔除蝦肉，保留蝦殼，清洗干凈后置于烘箱充分烘干。 每次烘干3 h，直到烘干前后兩次樣品質量保持不變，粉碎機處理后過80 目篩并儲存。

1.2.2 脫蛋白質工藝優化試驗方案

本試驗設定的3 個單因素分別為處理時間、 處理溫度和酶添加量。 每個試驗組向三角燒瓶中添加1 g經過預處理的蝦殼粉、20 mL 蒸餾水和中性蛋白酶，混勻后水浴加熱， 每組設定3 個平行試驗。 酶解結束后靜置，利用雙縮脲試劑和可見分光光度計測定上清液中的蛋白質含量， 用以判斷該條件下脫蛋白的效果，溶液的吸光度越高，說明該條件脫蛋白效果越好。

將三角瓶中殘留物過濾，傾去濾液，將濾渣沖洗至中性后放入烘箱烘干，即得第一級產物。

1.2.2.1 單因素試驗設計

以處理時間為單因素時， 設梯度為1、2、3、4、5 h，固定酶添加量為5 000 U，處理溫度為50 ℃。以處理溫度為單因素時，設梯度為30、40、50、60、70 ℃，固定酶添加量為5 000 U，處理時間為1 h。以酶添加量為單因素時，設梯度為1000、3000、5000、7 000、9 000 U，固定處理時間為1 h，處理溫度為50 ℃。

1.2.2.2 中性蛋白酶脫蛋白質工藝響應面設計

分別以處理時間、 處理溫度和酶添加量為自變量，依據單因素試驗結果設計各變量水平，中性蛋白酶脫蛋白質工藝的響應面試驗設計見表1。

表1 脫蛋白質工藝的響應面試驗設計Table 1 Design of response surface test for deproteinization process

1.2.3 脫鈣鹽工藝優化試驗方案

本試驗設定的3 個單因素分別為處理時間、 處理溫度和水與醋酸體積比。 每個試驗組向三角燒瓶中添加1 g 第一級產物、20 mL 醋酸溶液，混勻后水浴加熱，每組試驗進行3 個平行。 產物靜置后利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法測定上清液中的鈣離子的含量，用以判斷該條件下脫鈣鹽的效果，滴定過程中消耗的EDTA 量越大，說明該條件脫鈣鹽效果越好。

將三角瓶中殘留物過濾，傾去濾液，將濾渣沖洗至中性后烘干，即得到甲殼素。

1.2.3.1 單因素試驗設計

以處理時間為單因素時，設梯度為0.5、1、1.5、2 h，固定水與醋酸體積比為9 ∶1，處理溫度為40 ℃。 以處理溫度為單因素時，設梯度為20、30、40、50、60 ℃，水與醋酸體積比為9 ∶1，處理時間為1 h。 以水與醋酸體積比為單因素時，設梯度為4 ∶1、9 ∶1、14 ∶1、19 ∶1、24 ∶1，固定處理時間為1 h，處理溫度為40 ℃。

1.2.3.2 脫鈣鹽工藝響應面設計

分別以處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比為自變量，依據單因素試驗結果設計各變量水平見表2。

表2 脫鈣鹽工藝的響應面試驗設計Table 2 Response surface test design of decalcification process

1.3 甲殼素得率的計算

準確稱量1 g 經過預處理的蝦殼粉， 以優化后的脫蛋白質工藝進行脫除蛋白質，反復水洗并離心去除上清液，收集殘留物，晾干后稱重，計算第一級產物得率，試驗進行3 個平行。

準確稱量1 g 第一級產物， 以優化后的脫鈣鹽工藝進行脫鈣，離心去除上清液后收集殘留物，晾干后稱重，計算該步驟得率，試驗進行3 個平行。

2 結果與分析

2.1 中性蛋白酶脫蛋白質單因素試驗結果

使用中性蛋白酶處理粉碎后的蝦殼，分析處理時間、處理溫度以及酶添加量對中性蛋白酶脫蛋白質的影響，以雙縮脲法測定上清液中蛋白含量的吸光度為縱坐標，結果見圖1。

圖1 處理時間、處理溫度和酶添加量對中性蛋白酶脫蛋白效果的影響Fig.1 Effects of treatment time，treatment temperature and enzyme dosage on the deproteinization of neutral proteinase

在圖1a 中，吸光度隨著處理時間的增加先增加后減小，在2 h 時，吸光度達到最大值，此后吸光度隨著處理時間增加而遞減；在圖1b 中，吸光度隨著處理溫度的增加先增加后減小，在50 ℃時，吸光度達到最大值，此后，吸光度隨著處理溫度的增加而減小；在圖1c中， 吸光度隨著酶添加量的增加先增加后減小，在5 000 U 時，吸光度達到最大值，此后吸光度隨著酶添加量的增加而遞減。綜上，處理時間2 h、處理溫度50 ℃、酶添加量5 000 U 更有利于中性蛋白酶脫除蛋白質。

2.2 中性蛋白酶脫蛋白質工藝優化

以處理時間、處理溫度及酶添加量為自變量，在單因素試驗的基礎上，利用Design-expert 8.0.6 處理軟件進行響應面試驗的設計，試驗設計方案及結果見表3。

表3 脫蛋白質工藝響應面試驗方案及結果Table 3 Test plan and results of deproteinization process response surface

2.3 脫蛋白質工藝響應面試驗分析

回歸模型方差分析結果見表4。

表4 脫蛋白質工藝的響應面方差分析Table 4 ANOVA of deproteinization process response surface

由表4 可知，B、A2、B2、C2對工藝的影響極顯著，AB 的影響顯著，說明這3 個因素對脫蛋白的效果影響較為復雜。 模型顯著性檢測P＜0.000 1，說明此模型極顯著；模型失擬項P=0.060 7，不顯著，說明方程擬合度較高， 可以用于判斷3 個因素對蝦殼脫蛋白質效率的影響。 模型的決定系數R2=0.977 0， 調整決定系數=0.947 4，說明該模型可以良好的表現出選定的各個因素與響應值之間的關系[18]，CV 值為0.83%，CV 值較小，說明試驗的精度較高，試驗較為可靠[19-20]。 A、B、C 3 個因素的F 值分別為0.23、88.43、4.71， 說明了3個因素對脫蛋白率的影響程度由大到小依次是：處理溫度＞處理時間＞酶添加量。

脫蛋白試驗的殘差正態圖見圖2。

由圖2 可以看出， 所有數據均勻地分布在擬合分布線的兩側，不存在嚴重的偏差，與方差分析表顯示的結果一致。

圖2 脫蛋白試驗的殘差正態分布Fig.2 Residual normal map of deproteinization test

等高線圖可以表現各因素的交互作用，等高線越呈橢圓形交互作用越強。 響應曲面圖通過曲面的坡度來表現因素對響應值的影響程度，曲面坡度越大，說明響應值受到的影響越大[18]。 各因素交互作用對吸光度影響的響應曲面及等高線圖見圖3。

由圖3 可以看出，處理溫度與酶添加量、處理溫度與處理時間之間的交互作用的曲面坡度相對較大，而處理時間與酶添加量交互作用的曲面較平緩， 圖3 與方差分析表中數據相對應，進一步說明處理溫度對于中性蛋白酶脫除蝦殼蛋白質的影響較處理時間和酶添加量更為明顯。

圖3 各因素交互作用對吸光度影響的響應曲面及等高線Fig.3 Response surface and contour map of the interaction of various factors on absorbance

2.4 中性蛋白酶脫蛋白質的工藝驗證

依照響應面分析法所得到的最優脫蛋白質條件為：酶添加量5 090.26 U、溫度48.05 ℃、處理時間1.96 h，結合現實情況和試驗的便利性，取最優工藝為酶添加量5 000 U、溫度48 ℃、處理時間2 h。 按照此工藝進行5 次平行試驗，得到溶液的吸光度為0.185，與預測值0.185 2 差別很小，可以判定該模型適用，且確定此工藝為使用中性蛋白酶處理黃驊皮皮蝦蝦殼脫蛋白質的最優工藝。

2.5 醋酸脫鈣鹽單因素試驗結果

以滴定中消耗的EDTA 體積作為縱坐標反映上清液中鈣鹽的含量情況，處理時間、溫度和水與醋酸體積比對醋酸脫鈣鹽效果的影響見圖4。

圖4 處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比對醋酸脫鈣效果的影響Fig.4 Effects of treatment time，treatment temperature and acetic acid concentration on the decalcification of acetic acid

結果表明，處理時間為1 h、處理溫度為20 ℃、水與醋酸體積比為9∶1 時，消耗的EDTA 溶液最多，說明此時上清液中的鈣離子濃度最高。 隨著處理溫度的提高，上清液中鈣離子降低，推測可能是由于醋酸是一種具有強揮發性的酸，隨著處理溫度的提高，瓶內醋酸揮發量會逐漸增多， 從而使三角瓶內醋酸濃度下降，影響蝦殼脫鈣鹽的效率。

2.6 醋酸脫鈣鹽工藝響應面優化

以處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比為自變量，利用Design-expert 8.0.6 處理軟件進行響應面試驗的設計，試驗方案及結果見表5。

表5 脫鈣鹽工藝的響應面試驗方案及結果Table 5 Response surface test scheme and results of decalcification process

2.7 脫鈣鹽工藝的響應面試驗的分析

回歸模型方差分析結果見表6。

由表6 可知，二次項A2、B2、C2對脫鈣鹽的效率影響極顯著，3 個交互項影響均不顯著，說明這3 個因素對脫蛋白的效率影響較為簡單，醋酸脫鈣鹽的反應為比較單純的化學反應，3 個因素之間交互作用很弱。模型顯著性P<0.000 1，說明此模型極顯著；模型失擬項P=0.831 8，不顯著，說明方程擬合度較高，可以用于判斷處理溫度、處理時間和水與醋酸體積比對蝦殼脫鈣鹽效率的影響。 R2=0.978 3，R2Adj=0.950 4，說明此模型符合實際情況，CV=0.48%，CV 值小，說明試驗的精度較高，試驗較為可靠。A、B、C 3 個因素的F 值分別為0.32、2.87、1.53，說明3 個因素對脫蛋白率的影響程度由大到小依次是：處理溫度＞水與醋酸體積比＞處理時間。

表6 脫鈣鹽工藝的響應面試驗方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test for decalcification process

脫鈣鹽試驗的殘差正態圖見圖5。

圖5 脫鈣鹽試驗的殘差正態分布Fig.5 Residual normal diagram of decalcification test

由圖5 可知， 所有數據均勻地分布在擬合分布線的兩側，不存在嚴重的偏差。

各因素交互作用EDTA 消耗量影響的響應曲面及等高線見圖6。

由圖6 可知，在處理時間、處理溫度和水與醋酸體積比任一因素固定時，隨著另外兩個因素的升高，響應值先升高后下降。綜上可得，當處理時間1 h、處理溫度20 ℃、水與醋酸體積比8.92 ∶1 時，響應值最高，曲線較陡。 且等高線圖及相應曲面圖均與方差分析表中數據相對應，結果一致。

圖6 各因素交互作用EDTA 消耗量影響的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface and contour map of EDTA consumption influenced by interaction of various factors

2.8 醋酸脫鈣鹽的工藝驗證

依照響應面分析法所得到的最優脫鈣鹽條件為：處理時間1.02 h、 處理溫度20.17 ℃， 水與醋酸體積比8.92 ∶1。 結合現實情況和試驗的便利性，確定處理時間1 h，處理溫度20 ℃，水與醋酸體積比9 ∶1 為最優工藝。以此條件進行5 次驗證試驗，得到EDTA 的消耗量為4.26 mL，與預測值4.258 mL 差別很小，可以判定該模型適用，確定此工藝為使用醋酸處理黃驊皮皮蝦蝦殼脫鈣鹽的最優工藝。

2.9 甲殼素得率

準確稱量1 g 經過預處理的蝦殼粉進行脫除蛋白質后，計算第一級產物得率，3 個平行試驗得率分別為38.09%、38.19%和37.86%。 因此第一級產物最終得率為38.04%。

以1 g 第一級產物進行脫鈣，3 個平行試驗得率分別為17.92%、18.20%和18.04%， 該步驟最終得率為18.05%。

兩步驟得率乘積即為甲殼素最終得率。 所以，以黃驊當地特產皮皮蝦為材料，經本試驗優化方案制備甲殼素，得率為6.87%。

3 結論

本試驗以河北省滄州黃驊市的特產皮皮蝦蝦殼為原料，采取中性蛋白酶脫蛋白質、醋酸脫鈣鹽相結合的方式處理皮皮蝦蝦殼，探索并優化工藝條件，得到更加環保、有效率的甲殼素制備工藝。 本試驗確定中性蛋白酶脫蛋白的最佳工藝條件為處理時間2 h、 處理溫度48 ℃、酶添加量5 000 U；醋酸脫鈣鹽的最佳工藝條件為處理時間1 h、處理溫度20 ℃、水與醋酸體積比9 ∶1。經本研究優化后的甲殼素工藝，其得率為6.87%。 本試驗為利用中性蛋白酶結合醋酸制備甲殼素的工藝探究，為生物法結合化學法制備甲殼素提供一定的數據支持，以此拓寬利用水產品廢棄物進行精深加工的思路。