實時熒光PCR在虹鱒源性成分鑒別中的應用

劉金玉，季超，靳佳瑞，張芹，郝韞，解玉鑫，馮宇賾，李娟，伍志強，汪星宇，鄭文杰*

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.云南農業大學云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201）

虹鱒肌肉中蛋白含量、脂肪含量以及必需氨基酸含量均高于青魚、草魚、鰱魚等幾種常見的淡水魚[1-2]，其骨中蛋白質和脂肪含量分別為20.69%和22.8%，不飽和脂肪酸含量為83.54%，均高于一般魚類[3]，所以虹鱒的需求量及產量都與日俱增；根據聯合國糧農組織漁業統計數據， 從2008 年到2018 年全球虹鱒產量已從67.732 萬噸增長到84.919 6 萬噸； 就我國而言，2017 年我國冷水魚產量在5 萬噸左右， 其中虹鱒約占3.860 6 萬噸[4]。作為美味又富有營養的食品而言，虹鱒食用方法很多，主要的商品有生魚片、罐頭、魚糜、煙熏制品等，虹鱒魚皮還可以用作膠原蛋白的提取[5]。由于部分商品在加工過程中形態學特征受到不同程度的破壞，通過商品形態無法對其是否源自虹鱒進行判別[6]，所以常用核酸與蛋白質等方法對其真實性加以鑒別。 因蛋白質具有組織特異性且在食品加工過程中的高溫、 高壓以及高鹽處理可能會使其發生變性，檢測的準確性會受到影響[7]。 因此，基于核酸的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法成為目前用于水產品鑒別的主要方法。

實時熒光聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence PCR，RT-PCR）檢測在食品及魚類產品中應用已較為廣泛。 李秋陽等[8]對熒光定量PCR 檢測在食品中的應用做了相應的介紹，方軍等[9]利用實時熒光PCR 建立了對魚翅這種加工要求較高的產品的檢測方法，方法較為穩定可行；郭鳳柳等[10]也開發了針對摻假肉類的PCR 檢測方法；ZHAO 等[11]進行了以PCR-測流免疫分析法鑒定驢肉源性的研究；史瑩瑩等[12]建立了實時熒光定量PCR 鑒定肉制品中牛源性成分及其含量方法；羅建興等[13]利用實時熒光定量PCR 法檢測對食品中鵪鶉源性成分進行檢測；汪藝等[14]對水產品中的鱈魚建立了實時熒光定量聚合酶鏈式反應能快速鑒定3 種鱈魚。 李進波等[15]用實時熒光PCR 法鑒定食品中鮭亞科魚成分，并可用于市場上鮭科魚及產品的檢測。

本研究以虹鱒為研究對象，利用線粒體基因具有編碼效率高、在不同區域進化速度存在差異和母性遺傳等特點[16-17]，針對虹鱒較其它魚類在線粒體基因組上保守度相對較高的ATP6 設計特異性引物和探針[18-19]，建立針對虹鱒源性成分的實時熒光PCR 檢測技術，可用于檢測市售的三文魚產品是否含有虹鱒源性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

待檢測樣品： 市售的三文魚片4 份和網購的虹鱒魚籽、煙熏、烤制及虹鱒生魚片等18 份，詳見表1。

表1 待檢測樣品列表Table 1 List of samples to be tested

10 份虹鱒魚樣品： 青海民澤龍羊峽公司提供；帶魚、大黃魚、中國蘆花、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、鯽魚、石斑、藍鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長鰭金槍魚、錦鯉、大西洋鮭、多寶魚、鯧魚17 種非靶標魚樣品：市售。

動物組織基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；引物和探針：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設備

LightCyclerR480 II 實時熒光定量PCR： 美國Roche 公司；3K15 臺式高速冷凍離心機： 曦瑪離心機（揚州）有限公司；HH-S3 數顯恒溫水浴鍋：金壇市金南儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取0.1 g 樣品，加入600 μL 去離子水，在5 000 r/min條件下勻漿40 s。

1.3.2 DNA 的提取

將分別勻漿后的樣品，在6 000 r/min 條件下離心1 min，棄上清液留沉淀，使用動物組織基因組提取試劑盒進行樣品DNA 的提取，作為PCR 擴增的模板。

特異性試驗樣品準備：用青海民澤龍羊峽公司提供的10 份虹鱒魚樣品和本研究中收集的其它17 個非靶標魚類組織提取的DNA 來研究該方法的特異性。選取不同虹鱒魚的DNA 樣品10 份，經DNA 條形碼技術驗證后的帶魚、大黃魚、中國蘆花、秋刀魚、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、石斑、藍鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長鰭金槍魚、比目魚、鯉魚、大西洋鮭魚、鯽魚DNA 樣品各1 份備用。

DNA 靈敏度試驗樣品準備：選取青海民澤龍羊峽公司提供的虹鱒魚樣品的DNA，原始濃度為50 ng/μL，用去離子水分別稀釋為10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL 備用，其中50、10、1、0.1 ng/μL 每個濃度做4 次重復試驗；0.01、0.001 ng/μL 做8 次重復試驗驗證。

1.3.3 引物設計和選擇

從NCBI 數據庫中下載虹鱒、 大西洋鮭、 大馬哈魚、帝鮭、石斑、帶魚等25 種線粒體基因組全序列，利用Geneious Prime 2019 版對序列進行比對分析， 比對結果表明ATP6 基因在虹鱒中具有一定的保守性，利用軟件Primer Premier 5.0 設計引物。 引物和探針序列如表2 所示。

表2 虹鱒引物及探針Table 2 Primers and probes for Oncorhynchus mykis

利用DNA 條形碼技術對樣品進行驗證[20-22]，對收到樣品進行針對線粒體COX I 基因的部分特異區段的通用（＞99%）引物FISH F/R[23]測序，測序結果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對，選取相似度最高的結果進行系統進化樹的構建。

1.3.4 PCR 擴增

實時熒光PCR 反應體系為20 μL ∶0.2 μL 的TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），4 μL 的10×Ex Taq Buffer，3 μL的dNTP 混合液（2.5 mmol/L），0.4 μL 的ATP6-F（10 μmol/L），0.4 μL 的ATP6-R （10 μmol/L），0.6 μL 的Probe（10 μmol/L），9.4 μL 的無菌水，2 μL 的DNA。

參照LightCycler480 II 實時熒光PCR 儀使用說明書及TAKARA 公司TaKaRa Ex TaqRHot Start Version推薦的反應程序，設置反應程序：95 ℃預變性30 s，1 個循環；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環；40 ℃冷卻30 s，1 個循環。

2 結果分析

2.1 樣品真實性鑒定

利用DNA 條形碼技術驗證收集樣品真實性和準確性的結果如圖1 和表3 所示。 本研究所收集樣品和NCBI 數據庫序列比對相似度達99.9%。

表3 18 種魚類樣品名稱及測序結果Table 3 Names and sequencing results of 18 fish samples

圖1 18 份樣品的線粒體上COX I 的最大似然法和鄰接法分子進化樹Fig.1 The maximum likelihood and neighbor joining molecular evolutionary trees of COX I on the mitochondria of 18 samples

2.2 特異性試驗

選取青海不同虹鱒養殖場的虹鱒10 份，市售不同種類的魚17 份，用引物ATP6-F/R 進行PCR 擴增，結果如圖2 所示。

圖2 虹鱒源性成分檢測的特異性試驗Fig.2 Specific detection of rainbow trout-origin components

在32 個循環之前只對虹鱒進行了擴增， 對其它（大西洋鮭魚、帶魚、大黃魚、中國蘆花、秋刀魚、尼羅羅非魚、草魚、鲅魚、大眼鱖、石斑、藍鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、大目金槍魚、長鰭金槍魚、比目魚、錦鯉、鯽魚）17種魚、空白對照未見擴增曲線，說明該方法特異性良好，可用于虹鱒源性的樣品的檢測判定值為32 個循環，在32 個循環之前出現明顯擴增曲線的，判定為陽性；在32 個循環之前未出現明顯擴增曲線的，判定為陰性。

2.3 DNA 靈敏度試驗

驗證TaqMan 探針方法的DNA 靈敏度結果如圖3 所示。

由圖3 可知，在這6 個濃度梯中50、10、1、0.1 ng/μL在32 個循環前有擴增，0.01、0.001 ng/μL 在32 個循環之前無擴增，表明本方法的靈敏度為0.1 ng/μL。

圖3 DNA 濃度靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity of different DNA concentration

2.4 市售樣品的檢測結果

對表1 中1 號～22 號樣品的檢測結果如圖4 所示。

由圖4 可知，2 份市售三文魚生魚片和8 份網購的三文魚及制品在32 個循環之前出現明顯擴增曲線，判定為陽性即檢出虹鱒源性成分， 另外2 份市售三文魚生魚片和10 份網購的三文魚及制品在循環之前未出現明顯擴增曲線的，判定為陰性即未檢出虹鱒源性成分；對擴增結果進行測序分析，測序結果與測試結果一致。

圖4 市售樣品檢測的DNA 擴增譜圖Fig.4 DNA amplification profile of commercially available samples

3 結論

本研究首先對收集的樣品用線粒體COX I 基因的部分特異區段設計的引物FISH F/R 進行擴增測序，驗證了收集樣品的真實性；進而通過設計虹鱒特異性的引物探針， 建立了針對虹鱒源性成分的實時熒光PCR 檢測方法，利用17 種市場常見魚類進行檢測，結果表明本方法特異性良好，并根據試驗數據設定32 個循環以后出峰的是未檢出樣品，為陰性；經DNA 梯度稀釋驗證本方法的靈敏度為0.1 ng/μL， 對市售22 份標有鮭科魚源性成分的樣品進行測試，表明本方法可用于對市售產品中虹鱒源性成分的鑒別，同時也表明虹鱒是市售三文魚的主要魚種之一。