定量檢測PAX1 甲基化診斷宮頸癌前病變的應用分析

卡米拉·庫來西江 朱敏 姜敏 馬玉花 梁飛 來依寧 高靜

宮頸癌屬于一種常見的女性生殖器官惡性腫瘤,近年來的發病率明顯提高,嚴重危害了女性身體健康［1］。宮頸癌形成的重要原因之一為HPV 反復、持續感染,相關研究顯示,PAX1 基因甲基化表達異常升高可在不同層次、階段對癌前病變病理進程產生影響,和宮頸癌發生、發展存在密切相關性［2］。鑒于此,本研究分別對正常宮頸患者、低級別病變患者、高級別病變患者、癌變患者的宮頸刮片、組織標本進行收集,采用焦磷酸測序技術與反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對PAX1 基因甲基化行定量檢測,分析宮頸癌前病變診斷中PAX1 甲基化定量檢測的應用價值,并將本院136 例高危亞型HPV 患者作為研究對象,以期能獲得理想的研究結果,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年12 月～2020 年4 月在本院診治的136 例高危型HPV 感染患者為研究對象,以病理結果為依據分為四組,即甲組(正常宮頸,28 例)、乙組(低級別病變,32 例)、丙組(高級別病變,33 例)、丁組(癌變,43 例)。甲組患者,年齡32～55 歲,平均年齡(40.12±5.25)歲；乙組患者,年齡31～54 歲,平均年齡(40.09±4.83)歲；丙組患者,年齡32～56 歲,平均年齡(40.28±5.31)歲；丁組患者,年齡32～54 歲,平均年齡(40.08±4.79)歲。四組患者的一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 ①患者知情同意；②精神、認知功能正常；③經醫學倫理委員會批準。

1.2.2 排除標準 ①中途退出；②存在造血系統疾病；③存在免疫系統疾病；④妊娠者；⑤存在婦科良性或者惡性腫瘤病史。

1.3 方法

1.3.1 標本采集方法 指導所有患者取截石位,行常規消毒處理,獲取少量病變部位細胞之后,將其制作成為宮頸刮片,在陰道鏡下獲取宮頸組織行活檢,同時所有患者均接受HPV 檢查,獲取標本后保存于4℃溫度下,待用。

1.3.2 DNA 提取、擴增與修飾 采用Omniscript RT試劑盒(德國Qiagen 公司生產)對DNA 進行提取,并采用亞硫酸氫鹽進行處理,然后再行PAX1 基因轉錄,基因外側下游、上游引物分別為：5'-ACCCA GCTCATCCACACTCCC-3'、5'-AAGTTGATTT AGGGTTTGGGGT-3'；PAX1基因下游、上游引物分別為：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'、5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'。

1.3.3 基因測序 采用焦磷酸測序技術行PAX1 基因甲基化定量檢測,首先需合理配置混合液,包括熒光素酶14.6 mg/L、Klenow DNA 聚合酶18×10-3U/L、三磷酸腺苷雙磷酸酶2×10-3U/L、三磷酸腺苷硫酸化酶2×10-4U/L、D-蟲熒光素0.4 mmol/L、聚乙烯吡咯烷(PVP)0.4 μg/L、5’磷酸化硫酸腺苷(APS)3 μmol/L、二硫蘇糖醇(DTT)1 mmol/L、0.1%牛血清蛋白(BSA)、乙二胺四乙酸(EDTA)2 mmol/L、氨丁三醇(TAM)緩沖液0.1 mol/L。制作完成之后對樣本中PAX1 基因甲基化程度行定量測定,每份樣本甲基化程度為9 位點甲基化程度的平均值。

1.4 觀察指標 ①對比四組患者病變組織中的PAX1基因甲基化發生率、HPV 陽性率；②對比四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平；③通過ROC 曲線分析PAX1 基因甲基化診斷高、低級別癌前病變、正常宮頸的有效性。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四組PAX1 基因甲基化發生率、HPV 陽性率比較 甲組PAX1 基因甲基化患者0 例,發生率為0；乙組PAX1 基因甲基化患者2 例,發生率為6.25%；丙組PAX1 基因甲基化患者15 例,發生率為45.45%；丁組PAX1 基因甲基化患者43 例,發生率為100.00%。甲、乙、丙、丁四組患者的PAX1 基因甲基化發生率逐漸提高,比較差異具有統計學意義(P<0.05)。甲組HPV陽性患者9 例,陽性率為32.14%；乙組HPV 陽性患者26 例,陽性率為81.25%；丙組HPV 陽性患者30 例,陽性率為90.91%；丁組HPV 陽性患者40 例,陽性率為93.02%。甲、乙、丙、丁四組患者的HPV 陽性率逐漸提高,比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較 丁組患者宮頸組織、宮頸刮片中的PAX1基因甲基化水平均高于甲組、乙組、丙組,丙組高于甲組、乙組,乙組高于甲組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較(,%)

表1 四組宮頸組織與宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平比較(,%)

注：與甲組比較,aP<0.05；與乙組比較,bP<0.05；與丙組比較,cP<0.05

2.3 ROC 曲線分析 通過繪制ROC 曲線得知,PAX1基因甲基化診斷高、低級別癌前病變、正常宮頸的ROC 曲線下面積為0.88,采用PAX1 基因甲基化水平診斷高級別宮頸癌前病變可知,最佳閾值為4.15%,此時特異度為79.15%,靈敏度為89.39%。見圖1。

圖1 ROC 曲線分析

3 討論

研究顯示,從宮頸癌前病變發展成為宮頸癌需要較長時間,宮頸癌患者發病早期通常不會出現明顯臨床癥狀,等到有明顯臨床癥狀出現時,通常已經處于中晚期［3］。以往臨床多數研究顯示,宮頸癌前病變過程涉及多種基因改變,其中以DNA 甲基化為重要代表的表觀遺傳學改變尤為重要［4］。近年來的臨床研究顯示,PAX1 基因甲基化水平在宮頸癌組織中出現異常增高現象［5］。有學者針對我國臺灣地區進行分析,研究結果顯示宮頸癌患者PAX1 基因甲基化發生率高達89%,為此,臨床可嘗試將PAX1 基因甲基化水平作為早期診斷宮頸癌的一個重要標志物［6］。但臨床多數研究均認為,對PAX1 基因甲基化水平行定性分析難以量化判斷甲基化程度,只能用來診斷浸潤癌。大部分宮頸癌出現的原因為HPV 病毒反復、持續感染,因現階段臨床研究顯示低級別宮頸癌前病變發展為浸潤癌的可能性較低,所以為了降低宮頸癌發生率,需對高級別宮頸癌前病變進行及早篩查。

現階段,隨著細胞學檢查技術、HPV 病毒微量提取等各種技術被廣泛應用于臨床,多數早期浸潤性宮頸癌、宮頸癌前病變患者已經獲得及時診治。研究顯示,HPV 感染最終并不一定會發展成為宮頸癌或者癌前病變,這也就說明可能有其他協同因子在宮頸癌發生、發展過程中發揮作用。臨床多數研究顯示,癌基因異常表達會對腫瘤發生、發展產生多方面影響,例如調控細胞分裂與細胞增殖過程等,同時抑癌基因異常甲基化也會對抑癌基因表達進行抑制［7］。宮頸癌組織中PAX1 基因甲基化水平異常升高,并且可在宮頸癌脫落細胞中檢測到PAX1 基因甲基化。國外學者經研究發現［8］,宮頸癌早期診斷過程中,可將PAX1 基因甲基化水平作為重要輔助診斷方式之一,該診斷方式區分正常組織、宮頸上皮內瘤變(CIN)2 的特異度為92%,靈敏度為66%。雖然臨床關于宮頸癌患者PAX1基因甲基化水平的研究較多,但關于患病類型的鑒別區分卻較為少見。本研究采用定量分析方式對正常宮頸患者、低級別病變患者、高級別病變患者、癌變患者的PAX1 基因甲基化水平進行測定,結果顯示,甲組PAX1 基因甲基化發生率為0,乙組為6.25%,丙組為45.45%,丁組為100.00%,甲、乙、丙、丁四組患者的PAX1 基因甲基化發生率逐漸提高,比較差異具有統計學意義(P<0.05)。丁組患者宮頸組織、宮頸刮片中的PAX1 基因甲基化水平均高于甲組、乙組、丙組,丙組高于甲組、乙組,乙組高于甲組,差異具有統計學意義(P<0.05)。提示通過定量檢測PAX1 基因甲基化水平,可在一定程度上篩選宮頸癌高危人群,進而為之后的隨訪觀察提供重要依據。焦磷酸測序技術屬于新型DNA 序列分析方式之一,無需行熒光標記與電泳,可對多個甲基化位點進行同時檢測,進而獲取精準的定量PAX1 基因甲基化測定值。該分析方式不僅可以用來定量檢測甲基化程度,同時還具備高準確性與可重復性,相較于其他高通量測序技術,該分析方式的檢測成本也相對更低。本研究通過繪制ROC 曲線得知,PAX1 基因甲基化診斷高、低級別癌前病變、正常宮頸的ROC 曲線下面積為0.88,同時經初步研究分析得知,最佳閾值為4.15%時,PAX1 基因甲基化水平診斷高級別宮頸癌前病變的特異度為79.15%,靈敏度為89.39%,提示臨床可將PAX1 基因甲基化水平作為早期宮頸癌診斷的重要輔助方式之一。

綜上所述,宮頸癌前病變診斷中PAX1 甲基化定量檢測具有一定應用價值,可對高級別宮頸癌前病變進行有效鑒別。