NIH 法與改良NIH 法測定人用狂犬病疫苗效價的合格率比較

魏翠芬，李 明，吳志鵬，肖 堯，駱禹辰，趙紅梅，山 峰

（中科生物制藥股份有限公司 河北 三河 065201）

狂犬病是由狂犬病病毒感染中樞神經系統引起的一種古老的人獸共患傳染病[1]，臨床大多表現為特異性恐風、恐水、咽肌痙攣、進行性癱瘓等[2]。它是嚴重的世界性公共衛生問題之一，缺乏有效治療方法，全球每年約有59 000 人死于狂犬病[3]。安全有效的人用和獸用狂犬疫苗是預防狂犬病的最重要手段[4]。狂犬病疫苗作為目前唯一能預防和控制狂犬病的制劑，其研發和生產日益成為熱點[5]。自1885 年法國巴斯德研究院第1 支人用狂犬病疫苗誕生以來，人用狂犬病疫苗經歷了從神經組織疫苗到以細胞培養狂犬病疫苗以及從非純化、含佐劑和防腐劑疫苗到純化、不含佐劑和防腐劑疫苗的歷程[6]。隨著生物技術的不斷發展，制備工藝的逐漸提高，狂犬病疫苗的產品質量明顯提升[7]。作為狂犬病疫苗有效性的關鍵指標，效價檢測方法及準確性至關重要。目前人用狂犬疫苗的效價檢測方法主要有NIH 法和改良NIH 法，也有文獻記載建立人狂犬病病毒抗體ELISA 定量檢測方法，用于評價人用狂犬病疫苗的免疫效果[8]。NIH 法為WHO 推薦的狂犬病疫苗效價測定方法，也是歷版《中國藥典》規定的法定檢查法，在《中國藥典》2020 版中增加了人用狂犬病疫苗效價測定法第二法，即改良NIH 法。本文用NIH 法和改良NIH 法同時測定人用狂犬疫苗的效價，對兩種方法檢測能力進行比較。

1.資料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢驗樣品：人用狂犬病疫苗（某公司），共計20 個樣品，合格標準為不低于4.0 IU/劑。

1.1.2 參考疫苗：狂犬病疫苗（效力檢定用，中國食品藥品檢定研究院。批號：250009-201108，效價：6.6 IU/mL）。

1.1.3 CVS：狂犬病疫苗效價測定用攻擊毒CVS（簡稱CVS，中國食品藥品檢定研究院，傳代至使用代次）。

1.1.4 實驗動物：昆明小鼠（簡稱KM 小鼠，某公司，SPF 級）。

1.1.5 試劑：磷酸二氫鉀（分析純，Merck 公司）、磷酸氫二鈉（分析純，成都華邑藥用輔料制造有限責任公司）、氯化鈉（分析純，河北華晨藥業有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 效價測定用PBS（pH7.2 ～8.0）配制

1.2.1.1 甲液：稱取2.4 g 磷酸氫二鈉于燒杯中加適量水溶解，倒入量筒中加水稀釋至l00 mL。

1.2.1.2 乙液：稱取0.9 g 磷酸二氫鉀于燒杯中加適量水溶解，倒入量筒中加水稀釋至l00 mL。

1.2.1.3取甲液17 mL，乙液3 mL于燒杯中，加入1.7 g氯化鈉使其溶解后，倒入量筒中加水至200 mL，搖勻。測溶液pH 值在7.2 ～8.0 的范圍內，高壓滅菌（121℃，20 min），即得效價測定用PBS（pH7.2 ～8.0）。

1.2.2 NIH 法：用PBS 對樣品及復溶后的參考疫苗進行5 倍系列稀釋，取1:25、1:125、1:625 稀釋度，每個樣品每個稀釋度免疫12 ～14 gKM 小鼠16 只，每只KM小鼠腹腔注射0.5 mL，間隔一周后再免疫一次。第一次免疫后14 d，用含20 ～60 個LD50病毒量的CVS 進行攻擊，每只腦內注射0.03 mL；同時將攻擊毒稀釋到100、10-1、10-2、10-3，進行毒力滴定，每個稀釋度不少于8 只KM 小鼠。自攻擊后逐日觀察14 d，記錄死亡情況，統計第5 d后死亡以及呈典型狂犬病腦癥狀的小鼠數量。通過計算樣品和參考疫苗ED50值，最終計算樣品的相對效力，效力≥4.0 IU/劑為合格。

1.2.3 改良NIH 法：用PBS 對復溶后的參考疫苗進行288 倍稀釋；對樣品進行174 倍稀釋，取以上稀釋度的參考疫苗及樣品分別免疫12 ～14 gKM 小鼠10 只，每只KM 小鼠腹腔注射0.5 mL，間隔一周后再免疫一次，其余同NIH 法。當樣品的小鼠保護率大于參考疫苗時，樣品的效價判為合格。

1.2.4 每個樣品檢驗時，同一天用同一廠家同批次實驗動物，NIH 法與改良NIH 法同時進行。

1.2.5 將兩種方法測定的結果進行整理匯總，計算合格率。使用χ2檢驗對兩種方法的合格率進行統計學檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果與分析

2.1 共計使用人用狂犬病疫苗樣品20 個。檢驗結果如“NIH 法與改良NIH 法測定人用狂犬病疫苗效價結果對比表”所示，使用NIH 法檢測均為合格，合格率100%；用改良NIH 法檢測，19 個樣品合格（其中2 個樣品檢驗結果為4.0 IU/劑），1 個樣品結論為不合格，合格率為95%。經χ2檢驗，兩種方法的合格率差異無統計學意義（P＞0.05），改良NIH 法測定人用狂犬病疫苗效價與NIH 法相比無統計學差異，見表1。

表1 NIH 法與改良NIH 法測定人用狂犬病疫苗效價結果對比

2.2 NIH 法每個樣品使用48 只小鼠，同時每次實驗時參考疫苗組使用48 只小鼠，另外需要CVS 對照40 只小鼠，共計136 只。改良NIH 法每個樣品使用10 只小鼠，同時每次實驗時參考疫苗組使用10 只小鼠，另外需要CVS 對照40 只小鼠，共計60 只。

3.討論

目前檢測狂犬疫苗效力的國家標準第一法是美國國立衛生研究院（NIH）建立的小鼠體內方法，此法操作復雜，因而在2020 年出版的《中國藥典》中又提出了改良NIH法，改良NIH 法稀釋過程相對簡單，使用的動物數量明顯減少?！吨袊幍洹芬惨幎耸褂酶牧糔IH 法檢測效價的一些前提條件，如：采用該方法的實驗室已建立穩定的NIH 法且檢定結果一致性好，對NIH 法變異控制在較好范圍的實驗室；采用改良NIH 法測定效價不合格時，應以NIH 法測定，并作為最終判定結果[9]。

醫學的進步和醫學研究離不開動物實驗，實驗動物應該得到基本的尊重與關愛[10]。實驗動物是人類直接認識生命現象的重要媒介，生物醫學界中很多里程碑的科研成果都是通過實驗動物獲得的，它們對于促進生命科學的發展起著極其重要的作用[11]。伴隨著人們新的善待動物的觀念的興起，19 世紀科學界以及社會公眾圍繞動物實驗以及實驗動物相關問題展開了激烈爭論。最終，動物實驗“3 R”原則得到了確立。3 R 原則，系指在動物實驗中，采用替代（Replacement）、減少（Reduction）、優化（Refinement）的方法，它是維護實驗動物福利的重要原則。“3 R”原則既滿足了人們對動物的道德關切，又保障了科學的發展[12]。隨著社會的進步和科技的發展，實驗動物的福利得到越來越多的重視。實驗動物在生命科學及生物醫藥等多行業多領域的研發和實驗起著越來越重要的基礎性支撐作用，其巨大貢獻是以實驗動物身心遭受各類傷害為痛苦代價的[13]。支撐“動物福利論”的“3 R 原則”是中國福利倫理學界的共識，隨著GLP 實驗室質量管理體系的建立與發展，實驗動物福利倫理的要求將越來越高[14]。如何在保證動物實驗結果科學可靠的前提下來提升實驗動物的福利是每一個醫學科研工作者要考慮的問題[15]。尋找并發展有效替代實驗動物的有效方法已經成為研究焦點[16]。本次試驗中，與NIH法相比，改良NIH 法使用動物數量明顯減少，更加符合3 R 中的“減少”、“優化”原則。

綜上所述，改良NIH 法在測定疫苗效價上與NIH 法相比沒有顯著差異。改良NIH 法更符合3 R 中的“減少”、“優化”原則。但由于實驗數據較少，所得結果尚不能說明兩種方法在檢測能力上沒有差別，疫苗檢測時，是否可以采用改良NIH 法，還需要更多的實驗和數據支持。