免疫磁珠吸附去除紅細胞用于快速檢測冷凍復蘇后微量臍帶血造血功能的效果探討

吳潔瑩，吳韶清，陳勁松，陸 琰，湯雪薇，李 焱

（廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心<廣州臍血庫> 廣東 廣州 510623）

與骨髓和外周血干細胞的供者資料庫不同，臍血庫是將臍帶血以實物形式置于液氮中長期凍存，一旦與受者匹配，可在短時間內快速解凍并回輸。雖然極大提高了治療的可及性，但是，長期凍存和復蘇都會不可避免地影響臍帶血的造血功能[1-3]。由于臍帶血只能采集一次，數量有限，可供檢測的樣本更少。如何快速、準確地評價復蘇后臍帶血的造血功能，是臍血庫質量控制、產品放行，及移植中心供體選擇、風險評估等過程中都必須關注的重點[4-5]。本文探討非離心的免疫磁珠法在檢測冷凍復蘇后臍帶血造血功能中的應用。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣州臍血庫2014 年11 月—2018 年1 月的76份樣本（常規法組）和2018 年2 月—2020 年12 月的73份樣本（新方法組）。冷凍前從臍血采集袋取樣，復蘇后從附屬血辮取樣。此階段實驗室的操作環境和儀器設備運行穩定，技術人員相對固定，數據具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器IMDM 培養基購自美國Gibco 公 司， 批 號：1843036/2150863； 胎 牛 血清 購 自 美 國Gibco 公 司，批 號：1908360C；DNA 酶（RNase-Free DNase）購自美國Promega 公司，批號：0000231528/0000335463；ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 試劑盒購自加拿大Stemcell 公司，批號：19C101192/1000012783；臺盼藍染液購自Sigma 公司，批號：TRB0850；甲基纖維素半固體培養基購自加拿大Stemcell 公司，批號：18M98047/1000019901；流式抗體：CD45-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD34-藻紅蛋白（PE）、免疫球蛋白（IgG）-PE、7-氨基放線菌素（AAD）及溶血素購自美國BD 公司，批號：8311690/8341967/9015 728/9134970/9029989；生物潔凈工作臺購自蘇州蘇靜安泰空氣技術有限公司，型號：BCM-1600A；低溫高速離心機購自美國IEC 公司，型號：GP8 R；流式細胞儀購自美國BD 公司，型號：BD FACS Canto Ⅱ；血細胞分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司，型號：Ac.T diff2，恒溫水浴箱購自美國Coring 公司，型號LSE waterbath 6 L；旋渦震蕩儀購自美國IKA 公司，型號：LAB Dancer S25；醫用冷藏箱購自海信（北京）電器有限公司，型號：BCD-196TA；CO2培養箱購自德國Labotect 公司，型號：C200；倒置顯微鏡購自日本Olympus 及Nikon 公司，型號：CHK 及TE300。

1.2.2 常規法（洗滌離心）將臍血從液氮中移至氣相，放置5 min。打開鋁夾，取出附屬血辮，浸入37℃恒溫水浴箱，快速完成復溫。取100 uL樣本用于有核細胞計數、活率檢測，其余約400 ～500 uL 轉移至15 mL 無菌離心管，緩慢加入預冷的含2%胎牛血清（FBS）和10 U/mL DNase 的IMDM 培養基，輕輕搖動離心管。置10℃條件下，1 500 rpm、離心10 min。小心取出上清液，重懸細胞沉淀。重復洗滌離心一次。棄去上清，加入IMDM 培養基重懸細胞，用于CD34 陽性細胞檢測和干/祖細胞集落培養。

1.2.3 新方法（磁珠法）同前復溫后，取50 uL 樣本用于有核細胞計數。另取50 ～100 uL 樣本置于2 mL無菌離心管，加入280 uL 含2%FBS 的磷酸鹽緩沖液（DPBS）及170 uL ErythroClearTM試劑，用吸頭徹底混勻，室溫（15 ～25℃）孵育1 min 后，開蓋置于磁極中，靜置1 min。期間觀察是否出現細胞分層現象（即上層為透明清亮液體，底部為斜面狀紅細胞沉淀）。待分層穩定后，用1 000 uL 吸頭沿離心管壁，小心吸取上清液，轉移至另一新無菌離心管（切勿觸碰底層紅細胞沉淀），用于活率、CD34 陽性細胞檢測和干/祖細胞集落培養。詳見ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 試劑盒操作說明。

1.2.4 樣本檢測 有核細胞計數：采用全自動血細胞分析儀進行檢測。讀取屏幕上顯示的白細胞（WBC）數值，細胞總數=WBC×臍血體積。

細胞活率檢測：采用0.4%臺盼藍染色檢測活細胞數量，計數100 個有核細胞，被染色的為死細胞，未染色的為活細胞，計算活細胞比例。

CD34 陽性細胞計數：標記流式管，設同型對照，將制備好的細胞懸液各50 uL 分別加入對照管及實驗管，對照管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL IgG-PE 熒光抗體，實驗管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL CD34-PE 熒光抗體，避光孵育20 min。各管分別加入5 uL 7-AAD，繼續孵育5 min。加入2 mL PBS，于1 500 rpm 離心5 min，棄上清，再以300 uL PBS 重懸細胞沉淀，上機檢測。采用洗滌離心制備的細胞懸液，標記后還要溶血。分析結果得到CD34 陽性細胞占CD45 陽性有核細胞的百分比，再根據復溫后臍血的細胞總數，計算出每份臍血中的CD34 陽性細胞的數量。

造血祖細胞集落分析：采用MethodCult（GF H4434半固體甲基纖維素培養基，以105細胞/mL 的密度接種于12 孔板中，每孔終體積1 mL，每樣本設雙復孔。置37℃、5% CO2飽和濕度下培養14 ～16 d。倒置顯微鏡下觀察粒-巨噬細胞集落形成單位（CFU-GMs）、爆式紅細胞集落形成單位（BFU-E）和粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落形成單位（CFU-GEMM），求和得到祖細胞集落形成單位總數（CFUs），再根據復蘇臍血的細胞總數，計算出每份臍血中的集落數量。

1.3 觀察指標

選擇兩組樣本冷凍前后的總有核細胞數、細胞活率、CD34 陽性細胞數、CFU-GMs 及CFUs 和上述各項參數的變化（回收率）為觀察指標，計算公式如下。

總有核細胞回收率（%）=（復蘇后細胞數/冷凍前細胞數）×100%。

細胞活率（%）=[活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）]×100%。

細胞活率回收率（%）=（復蘇后細胞活率/冷凍前細胞活率）×100%。

CD34 陽性細胞回收率（%）=（復蘇后CD34 陽性細胞數/冷凍前CD34 陽性細胞數）×100%。

CFU-GMs 回收率（%）=（復蘇后CFU-GMs 數量/冷凍前CFU-GMs 數量）×100%。

CFUs 回收率（%）=（復蘇后CFUs 數量/冷凍前CFUs 數量）×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析。計量數據以均數±標準差（± s）表示，組間比較采用t檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗；連續變量之間的相關性采用Spearman 相關性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組臍血的冷凍前和復蘇后的各項參數及回收率比較

兩組樣本復蘇后的總有核細胞數、細胞活率、CD34陽性細胞數、CFU-GMs 及CFUs 數量較冷凍前均有所降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。新方法組的細胞活率的回收率低于常規法組，差異有統計學意義（P＜0.001），而兩組的有核細胞回收率、CD34 陽性細胞回收率、CFUGMs 回收率和CFUs 回收率等的差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組臍血的冷凍前和復蘇后的各項參數及回收率比較

2.2 兩組臍血的復蘇后CD34 陽性細胞數和CFUs 的相關性分析

兩組樣本的CD34 陽性細胞數和CFUs 數量均有相關性（新方法組：r=0.744，P＜0.001；常規法組：r=0.631，P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組臍血的復蘇后CD34 陽性細胞數和CFUs 的相關性曲線

3.討論

臍帶血的制備是采用儀器或手工分離法，去除大部分的血漿和紅細胞，收集富含造血干細胞等多種干細胞及免疫細胞的白膜層，保存于液氮中的完整過程。為保證回收率，終產品可能含有一定比例的紅細胞，而這些紅細胞會影響造血干/祖細胞（HSPCs）的造血功能評價，如：CD34 陽性細胞流式檢測、集落形成單位數量分析，乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測等的準確性[6-7]。常規去除紅細胞的方法包括洗滌沉降法或氯化銨裂解法，均需要較長作用時間或離心，對冷凍復蘇后樣本，易造成細胞損傷、凝塊，導致細胞丟失。與冷凍袋相比，附屬血辮中的微量樣本在降溫程序中處于更低的溫度，對冰晶損傷可能更敏感，因此常規方法尤其不適于冷凍袋的附屬血辮中微量樣本的檢測[8-10]。本庫自2018 年2 月起，采用加拿大Stemcell 公司的ErythroClearTM試劑盒，取代洗滌離心溶血的常規方法，對臍帶血附屬血辮中的微量樣本進行檢測。雖然兩種方法制備的臍血樣本的總有核細胞數、細胞活率、CD34 陽性細胞數、CFU-GMs 及CFUs較冷凍前均有所降低（P＜0.05），但是，兩組樣本的冷凍前后CD34 陽性細胞回收率，粒-巨噬細胞集落回收率、祖細胞集落回收率均無顯著差異（P＞0.05）；同時，兩組樣本復蘇后的CD34 陽性細胞數和CFUs 均存在高度相關性，表明CD34 陽性細胞數的測定結果均能準確反映出具有該標記的造血干/祖細胞的生物學特性，新方法不會改變樣本的造血干/祖細胞分布頻率和增殖能力。但本研究的數據也顯示，新方法組的細胞活率的回收率低于常規法組，表明新方法對細胞活率的檢測有一定影響。

新方法的優勢主要有兩個方面：首先是減少操作時間，提高制備效率：常規法將復蘇后的臍帶血加入預冷的培養基稀釋后，小心混勻離心洗滌兩次，棄去上清，加入緩沖液，反復輕柔吹打調整至適宜濃度的細胞懸液，操作時間大于20 min；而磁珠法將樣本加入緩沖液和磁珠分離試劑，混勻后靜置1 min，再放入磁極作用約1 min 或至細胞懸液清晰，即可吸出上清液。由于磁極有16 個樣本位，可在約2 min 內同時完成16 個待檢樣本的紅細胞分離，極大地提高了制備效率。其次是節約樣本量，改善制備質量：磁珠法僅需要約50 ～100 uL 的血樣制備細胞懸液，并可立即用于流式分析和干/祖集落培養，若置于4℃靜置存放，也很少出現細胞凝集成團的現象；而常規法需要400 ～500 uL 血樣，經過反復離心、洗滌、吹打，即使在體系中加入DNase，也容易產生肉眼可見的細胞凝塊。為保證流式檢測中管路通暢，順利收集到細胞信號，通常需要用400 目濾膜去除凝塊。同時，由于損失了相當數量的細胞，給流式結果的分析造成一定困難。

當然，新方法也存在局限性。首先，磁珠吸附后獲得的細胞懸液終體積約500 uL（上樣體積為550 uL，扣除吸附在磁極中的紅細胞及磁珠沉淀），有時會導致細胞終濃度偏低；若減少上樣體積，又會影響分離體系和磁極作用面積，降低分離效率。如果后續實驗對樣本濃度和樣本體積有要求（如細胞分選），則須增加離心濃縮步驟。另外，磁極作用后的細胞活率會降低，但在處理新鮮血液樣本時，此現象并不明顯（數據未顯示），推測可能原因有：（1）與磁場有關，冷凍復蘇后的細胞對磁場作用更敏感；（2）與試劑有關，磁珠或緩沖液可能與檢測細胞活率的試劑發生干擾，造成假陽性，值得進一步研究。

綜上所述，免疫磁珠法可用于快速檢測冷凍復蘇后的臍帶血造血功能，特別適用于冷凍袋附屬血辮的微量樣本。以本庫采用的50 mL CryoMACS?冷凍袋為例，含有臍帶血終產品的冷凍袋在密封前應保留的一段附屬連接管（血辮），其容量約為600 uL。每次需100 uL 血量，使總量約600 uL 的附屬血辮可分為數小段，進行多項目多次檢測，可以滿足現行的全球先進輸血和細胞治療聯盟（AABB）《細胞治療服務標準（第9 版）》（9th edition）中“臍血產品至少需要兩個完整的附屬血辮與產品一起冷凍保存”及“用于造血重建的產品在附屬連接段取樣檢測集落形成單位和（或）CD34 陽性細胞（直接測量）”的規定[11]。