套作白三葉草對香蕉枯萎病發病率及土壤微生物群落的影響

劉滿意，王禹童，孫銘澤，李 榮，王蓓蓓

（1. 海南大學 熱帶作物學院，海口 570228; 2. 南京農業大學 資源與環境科學學院，南京 210095）

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、黃葉病，是一種典型的導致維管束系統毀滅的土壤真菌病害，首次于1904年在美國夏威夷被發現[1-2]，是由古巴專化型的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysopoyumf. sp.Cubence)引起[3]，在香蕉的整個生育期內都會出現。尖孢鐮刀菌會破壞維管束結構、堵塞木質部導管，從而引起假莖開裂、葉片發黃等癥狀，最終植株枯萎死亡。一百多年來，香蕉土傳枯萎病一直是全球香蕉產業最大的障礙，在許多國家和地區均有報道，并造成嚴重的危害[4]。研究表明，長期的香蕉連作使土壤酸度增加，病原菌積累，土壤微生物群落失衡[5-7]。目前，對香蕉連作障礙采用的措施主要有：選育抗病品種、化學藥劑、施用生物有機肥和輪作[8-11]。但是，香蕉是無性繁殖，選育抗病品種非常困難；化學藥劑對土壤和農作物污染嚴重；生物肥料的防治效果還有待提升；輪作不利于保持香蕉的經濟效益[12]。因此，現在急需一種有效的防治香蕉枯萎病的方法[13]。近年來，利用套作來調控土壤微生物群落的報道逐漸增多。研究表明，玉米與花生套作能有效地改變土壤微生物的群落組成和優勢物種的種類[14]。張蒙蒙等[15]的研究結果表明，桑樹與紫花苜宿套作能改善土壤真菌的多樣性，增加真菌的豐富度。香蕉與韭蔥套作能有效地減少土壤中總鐮刀菌的數量[16]，套作豆類和谷類作物可以提高豆科固氮能力[17]，芥菜套作豆科作物增加了產量穩定性、養分有效性和水分利用效率[18]。目前，關于香蕉行間套作的研究不多，尤其是套作豆科綠肥的研究較少。在黃瓜園中套作白三葉草(Trifolium repensL)，可顯著降低黃瓜枯萎病發病率[19]。因此，筆者以白三葉草為套作作物，以不套種為對照，研究套作白三葉草對連作蕉園香蕉枯萎病的發病率以及土壤微生物的多樣性、結構和組成的影響，旨在為套作防控香蕉枯萎病和改善蕉園土壤微生物生境提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗概況本試驗于2018年9月至2019年6月在海南省澄邁縣香蕉基地（19°N，109°E）進行。該地區屬熱帶季風氣候，年平均氣溫23.8 ℃，降水量1 786.1 mm，且熱雨同季，臺風影響較弱；試驗田土壤為磚紅壤（連續單作香蕉8年）。土壤基本化學性質：pH 5.53，堿解氮93.47 mg·kg-1，銨態氮14.19 mg·kg-1，硝態氮10.81 mg·kg-1，速效磷96.57 mg·kg-1，速效鉀672 mg·kg-1，有機質3.64 g·kg-1。試驗田所種香蕉品種 為巴西蕉（Mimosa nanaLour.），1株留1個吸芽。供試綠肥為白三葉草(Trifolium repensL)。

1.2 試驗方案2018年9月將白三葉草進行地面撒播。設置處理如下：單作香蕉(MB)、香蕉套作白三葉草（IB）。每個處理3次重復，隨機分布，并設置保護行。每個重復小區種植60棵香蕉，寬窄行種植，寬行行距3 m，窄行行距2 m，香蕉株距2 m。綠肥在香蕉寬行間撒播，白三葉草行距30 cm，播種量為6 kg·hm-2，為常規播種量。水分管理：苗期和果實成熟期使田間持水量保持在75%左右，快速生長期、抽蕾期和果實生長期使田間持水量保持在85%左右。施肥管理：底肥，每株施腐熟的羊糞有機肥5 kg，同時添加磷肥0.2 kg，均勻拌入施肥穴；前期追肥（前3個月），每15～20 d追施1次肥，每株每次淋施15 g尿素和15 g硫酸鉀復合肥(15-15-15)；中期追肥（快速生長期至抽蕾前），每15～20 d追施1次肥，每株每次淋施15 g尿素、60 g硫酸鉀復合肥和160 g硫酸鉀；后期追肥（抽蕾期至采收期），每25～30 d追施1次肥，每株每次淋施50 g尿素、80 g硫酸鉀復合肥和110 g硫酸鉀。

1.3 樣品采集與指標測定方法在田間試驗結束時采集土壤樣品，各重復小區選取5株健康香蕉，在香蕉滴水線以內用土鉆隨機取4個土樣，收集5～20 cm的表層土壤，然后將這5株香蕉的土樣混合為1個土壤樣品。每個處理采集3個重復，共15株香蕉。取土后過2 mm篩，用四分法取約100 g放入超低溫冰箱，用來提取DNA，用于高通量測序；取約300 g土風干后測定化學性質。

在種植中，自出現典型香蕉枯萎病癥狀時開始統計發病率。當香蕉植株出現黃葉、假莖開裂并呈褐色、新葉較小等典型的癥狀，即統計為發病植株，每7 d調查1次，直至試驗結束。香蕉枯萎病的發病率按下式計算：

用pH計法測定土壤pH值（m水∶V土=1∶2.5），油浴法測定土壤有機質，擴散堿解法測定土壤堿解氮，0.03 mol·L-1氟化銨-鹽酸(0.025 mol·L-1)浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷，1 mol·L-1中性乙酸銨溶液浸提-火焰光度計法測定土壤速效鉀。2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提-紫外分光光度計法測硝態氮，2 mol·L-1氯化鉀溶液浸提-靛酚藍比色法測銨態氮。具體方法詳見《土壤農化分析》[20]。

將每個重復的土壤樣品提取2次DNA，取約0.8 g混合土壤樣品，用MOBIO的土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）提取土壤DNA。每個處理共提取6次DNA。提取好的DNA用核酸定量儀（NanoDrop 2000，Thermo Scientific，USA）測定其核酸濃度后于-20 ℃冰箱保存。每個重復分別吸取20 μL樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進行測序。細菌16S rRNA (V3+V4)區域采用引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，真菌ITS1區域采用引物：5′-C TTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.4 數據處理測序返回的原始序列用USEARCH 11按標準流程分析。用97%相似性的稀疏曲線來判斷測序深度的合理性。Mothur軟件用于Alpha及Beta多樣性分析。基于貝葉斯距離（Bray-distance）進行各處理間的主坐標分析（Principal Coordinates Analysis），用于比較各處理土壤中細菌和真菌的群落結構差異。

采用Microsoft Excel 2017軟件進行數據處理與繪圖，采用IBM SPSS Statistics 20統計分析軟件，通過 獨立樣本t檢驗進行數據比較，檢驗處理間的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 套作白三葉草對香蕉枯萎病發病率的影響與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理顯著降低了香蕉枯萎病的發病率（圖1-a）和尖孢鐮刀菌的相對豐度（圖1-b）。單作香蕉處理和套作白三葉草處理的香蕉枯萎病發病率分別為41.67%和28.33%，尖孢鐮刀菌相對豐度分別為13.10%和7.04%。相比于單作香蕉處理，香蕉套作白三葉草處理枯萎病發病率降低了13.34%，尖孢鐮刀菌相對豐度減少了6.06%。

圖1 不同處理的香蕉枯萎病發病率和尖孢鐮刀菌相對豐度注：MB：單作香蕉；IB：香蕉套作白三葉草。不同字母表示處理間差異顯著（P＜0.05），下同。Fig. 1 The disease incidence of banana Fusarium wilt and relative abundance of Fusarium oxysporum in different treatmentsNote: MB: Banana monoculture; IB: Intercropping of banana with white clover. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P＜0.05), similarly hereinafter.

2.2 套作白三葉草對連作蕉園土壤化學性質的影響由表1可知，與單作香蕉處理（MB）相比，香蕉套作白三葉草處理（IB）土壤的速效磷含量、有機質含量、銨態氮含量和硝態氮含量均降低(P＜0.05)，pH值和速效鉀含量增加(P＜0.05)。

表1 套作白三葉草對土壤化學性質的影響Tab. 1 Effects of intercropping of banana with white clover on soil chemical properties

2.3 套作白三葉草對土壤微生物Alpha多樣性的影響從表2可知，相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理土壤真菌的豐富度和多樣性均顯著增加。細菌的Chao、Ace和Shannon指數在處理間的差異不顯 著，而Invsimpson指數顯著高于單作香蕉處理。

表2 土壤微生物的Alpha多樣性指數Tab. 2 Soil microbial alpha diversity indexes in different treatments

2.4 套作白三葉草對土壤微生物Beta多樣性的影響基于Bray-curits距離的主坐標分析（圖2）結果表明，單作香蕉和套作白三葉草處理的細菌群落結構差異顯著，第1和第2主坐標軸分別解釋了總差異的41.90%和10.76%，單作香蕉和套作白三葉草處理沿第一軸（PCoA 1）明顯區分開來（圖2a）。由圖2b可以看出，單作香蕉和套作白三葉草處理的真菌群落沿第一軸（PCoA 1）明顯區分開，第一和第二主坐標軸分 別解釋了總差異的55.01%和7.54%。

圖2 基于Bray-curits距離的細菌（a）和真菌（b）群落主坐標分析Fig. 2 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterial (a) and fungal (b) community based on Bray-curits distance

2.5 套作白三葉草對土壤微生物群落組成的影響2個處理土壤微生物門水平組成的結果如圖3所示。由圖3-a可以看出，套作白三葉草（IB）和單作香蕉（MB）的細菌優勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria）。與單作香蕉處理相比，套作白三葉草土壤的變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）相對豐度顯著增加；放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著降低。由圖3-b可以看出，各處理真菌優勢門為子囊菌門（Ascomycota），與單作香蕉相比，套作白三葉草土壤的擔子菌門（Basidiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）和接合菌門（Zygomycota）相對豐度增加；子囊菌門（Ascomycota）相對豐度降低。

圖3 細菌（a）和真菌（b）門的相對豐度注：MB：單作香蕉；IB：香蕉套作白三葉草。Fig. 3 The relative abundance of bacterial (a) and fungal (b) phyla Note: MB: Monoculture of banana; IB: Intercropping of banana with white clover.

用Venn圖來表示細菌、真菌在2個處理中共有OTU的數量，并計算其在總OTU里面所占的比例。單作香蕉（MB）土壤中，細菌和真菌OTU的數量分別為1 307個和628個。套作白三葉草（IB）土壤中有1 324個細菌保留OTU，667個真菌保留OTU。2個處理中共有的細菌和真菌OTU分別占總OTU數量的94.74%和88.22%（圖4）。

圖4 不同處理中土壤的細菌（a）和真菌（b）OTU分布Venn圖Fig. 4 The venn diagram of bacterial (a) and fungal (b) OTU distribution of soil in different treatments

2個處理土壤微生物屬水平組成的結果如圖5所示。由圖5-a可以看出，與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理土壤細菌的Desulfovirgula屬、Gp16、Gp6、Kofleria屬、硝化螺菌屬（Nitrospira）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、Spartobacteria和Syntrophorhabdus屬相對豐度增加，Bacillus屬、Gaiella屬、Gp1、Gp3、Gp4和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）相對豐度降低。

由圖5-b可以看出，相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理土壤真菌的Davidiella屬、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）、梭孢殼屬（Thielavia）、阿太菌屬（Athelia）和黑團孢屬（Periconia）相對豐度增加。而鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、盤菌屬（Peziza）、Naumovozyma屬、Cercophora屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對豐度降低。

圖5 各處理土壤細菌（a）和真菌（b）屬水平豐度圖Fig. 5 Relative abundance of the top 20 classified bacteria (a) and fungi (b) in the soil under different treatments

相對豐度較高的前20個細菌屬和真菌屬，分別與尖孢鐮刀菌做皮爾森相關性分析，篩選出具有顯著負相關關系的屬（表3）。其中，細菌屬的GP6、GP16、兔芽孢菌屬（Spartobacteria_genera_incertae_sedis）、Desulfovirgula菌、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Syntrophorhabdus菌和Kofleria菌與尖孢鐮刀菌（Fusarium）呈負相關關系(P＜0.05)。真菌中，Davidiella菌、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）、梭孢殼屬（Thielavia）、阿太菌屬（Athelia）和黑團孢屬（Periconia）與尖孢鐮刀菌（Fusarium）呈負相關關系(P＜0.05)。

表3 土壤尖孢鐮刀菌與微生物屬水平相對豐度的Pearson相關性Tab. 3 Pearson correlation between the relative abundance of genera and Fusarium

由屬水平豐度圖（圖5）可以看出，GP16、Davidiella菌、圓孢霉屬（Staphylotrichum）、支頂孢屬（Acremonium）、被孢霉屬（Mortierella）和阿太菌屬（Athelia）明顯在香蕉套作白三葉草處理的土壤中富集，且與尖孢鐮刀菌的數量呈負相關關系(P＜0.05)。

3 討 論

長期連作種植和不合理的施肥方式導致蕉園地發生嚴重的連作障礙，土壤板結、土壤容重下降、土壤微生物群落失衡，進而加劇了土傳病原菌的迅速繁殖[21]。病原菌的數量與香蕉枯萎病的發病率具有顯著正相關關系[22-23]。改善蕉園土壤微生物區系，降低尖孢鐮刀菌的數量是防控香蕉枯萎病的有效手段。本研究結果表明，套作白三葉草處理的枯萎病發病率和尖孢鐮刀菌相對豐度均顯著低于單作香蕉處理。因此，套作白三葉草對尖孢鐮刀菌有一定的抑制效果，能在一定程度上有效地防控香蕉枯萎病。

與單作香蕉處理相比，套作白三葉草處理顯著提高了土壤pH值和速效鉀含量(P＜0.05)，這與楊勁明等[24]的研究結果一致。很多報道認為，土壤肥力水平很大程度上影響土壤微生物的群落結構和組成，從而影響香蕉土傳枯萎病的發生[25-26]。本試驗結果中，較高的土壤pH值和土壤速效鉀含量可能是抑制香蕉枯萎病的關鍵肥力因子。土壤pH值往往與枯萎病發病率呈負相關關系，這已被很多研究證實[27-28]。廖明莉等[29]利用4種豆科綠肥與小麥間作，發現4個綠肥品種均能顯著提高土壤中P2O5的含量，提高效應達40.0%～50.9%。除此之外，植物與土壤微生物之間通過植物根系建立起密切聯系[30]。套作作物作用于土壤，其根系占據生態位，通過根系與土壤之間的物質交換改變了土壤微生物生活的根際微環境，進而影響了土壤微生物群落，甚至有些作物的根系分泌物中的化感物質會抑制病原菌的生長[31]。趙夢麗等[32]通過研究擬南芥根系分泌物對土壤微生物群落組成和功能的影響時指出，根系分泌物可以改變土壤微生物群落結構，增加微生物中與養分循環相關的功能基因的多樣性。在本試驗中，Alpha多樣性分析結果表明，套作白三葉草處理擁有更高的真菌多樣性和豐富度。但是，對于細菌，只有InvSimpson指數顯著高于單作香蕉處理。主坐標分析結果顯示，土壤細菌和真菌群落結構均沿第一主坐標明顯區分開來。這種群落的顯著變化，可能是由于套作白三葉草后土壤微生物的生存環境變化所致[33]。因此，香蕉園套作白三葉草可以顯著改變部分肥力因子，并且改變土壤微生物多樣性和群落結構。

不同處理土壤中細菌和真菌群落組成在門水平有明顯的差異。其中，高通量測序結果顯示，在本試驗蕉園土壤中，細菌的優勢門為變形菌門（Proteobacteria）、真菌的優勢門為子囊菌門（Ascomycota），且相比于單作香蕉處理，套作白三葉草處理顯著增加了細菌變形菌門的豐度，降低了真菌子囊菌門的豐度。研究證明，變形菌門具有抑制枯萎病的作用[34]，并且子囊菌門為大多數病原真菌所屬的門，很多研究指出，真菌子囊菌門的降低是香蕉土傳枯萎病發病率降低的重要特征[21,33]。因此，本試驗中，變形菌門的增多和子囊菌門的降低也是導致套作白三葉草處理發病率降低的重要因素之一。韋恩分析結果顯示，套作白三葉草處理的細菌和真菌都出現了很多特有的OTU，表明套作白三葉草處理明顯改變了土壤微生物群落組成，并且優勢屬水平的豐度圖表明，相比于單作香蕉處理，GP16、Davidiella等菌明顯在套作白三葉草處理的土壤中富集，相關性分析也證明這些菌與尖孢鐮刀菌都呈顯著負相關關系(P＜0.05)。有研究表明，酸桿菌門里一些屬的改變和土傳病害的發病率有較高的相關性[35]，本試驗套作處理中GP16的富集，可能是屬水平上導致枯萎病病原菌數量和發病率降低的重要因素。

綜上所述，在蕉園中套作白三葉草可以改變部分土壤肥力指標，改變土壤微生物的生存環境，重塑土壤微生物區系。套作白三葉草處理中病原菌相對豐度降低，土壤微生物多樣性提高，土壤微生物群落結構和組成明顯改變，這可能是導致香蕉枯萎病發病率降低的主要原因。本試驗結果可以為蕉園套作豆科綠肥防控香蕉枯萎病提供借鑒。