火龍果采后病原菌的鑒定及其防控處理的優化

葛春暉，尤文靜，蔣澤橙，成梓瑜，湯 月，邵遠志

（1. 海南大學 食品科學與工程學院，海口 570228; 2. 海南大學 生命科學與藥學院，海口 570228）

火龍果 (Hylocereus undatus)是一種仙人掌科植物，原產地在南美洲和中美洲等部分地區，屬于典型的熱帶植物，在我國引入后，得到了廣泛的馴化和改良，品種更加豐富，目前在我國廣東、廣西、海南以及福建等地區均有推廣種植和栽培，成為了一種倍受人們喜愛的熱帶水果[1-2]。近些年來, 伴隨著我國的火龍果種植栽培面積不斷擴大，一些相應的病害也隨之產生，并且火龍果采后病害呈現出逐漸加重的趨勢。火龍果在采摘后的儲藏運輸過程中，由于自然衰老，果實會褐變萎蔫，在褐變萎蔫中還會受到多種微生物侵染造成腐爛變質，其中真菌病害十分普遍[3-4]。據報道，海南地區火龍果采后主要病害有炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、根霉病(Rhizopus stolonifer)、焦腐病(Botryodiplodia theobrom)，偶見鐮刀菌果腐病(Fusariumsp)等[5]。這些病害對當地的果蔬產業造成了一定的經濟損失。

化學殺菌劑在針對果蔬病害的防治中占據著主要地位，使用化學殺菌劑是防治果蔬采后病害的重要方式，但其易殘留、會造成環境污染、易產生抗藥性等缺點一直被人們詬病[6]。近年來，生物防治作為綠色安全的新興防治技術成為國內外果蔬采后病害防治的研究熱點。生物防治技術主要分為3類：微生物菌體及其代謝產物、天然提取物和基因工程技術[7-8]。拮抗菌防治病害有著不可替代的優勢和潛力，是針對果蔬采后病害防治極其重要的生防材料。拮抗菌主要種類有酵母菌、細菌、霉菌等，且部分菌株已實現了商業化應用[9-10]。許多天然植物提取物中含有具有抗菌、抗氧化功能的活性物質，其中包括從食用香辛料和中草藥等提取的有效成分，這些活性物質普遍具有較強的抑菌活性，且被認為有利于開發成天然新型果蔬防腐保鮮劑[11]。

綜合拮抗菌和天然植物提取物的優勢，加之兩者都能夠對病原菌起到一定的防控抑制作用，因此本研究以從火龍果上分離得到的病原菌為研究對象，篩選對火龍果采后果腐病具有較好防效的天然植物提取物，結合本實驗室已有的拮抗菌（JK-A1枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和JK-L1廣島鏈霉菌Streptomyces hiroshimensis），探究2種生物抑菌保鮮方式的有效結合途徑。對于拓寬火龍果采后病害的防 控途經，提高生防安全性，具有十分重要的理論意義和研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器供試果實購自海南省海口市南北水果市場，做為病原菌分離純化（放置于室溫陰涼處待其自然發病后取樣）和用于致病性測定；供試土壤取自海南省海口市火龍果園，取果樹根系離土表5～15 cm 的土壤樣品，用密封袋封存，做好標記帶回實驗室用于拮抗菌的分離；供試香辛料（生姜和大蒜）和香蕉皮、石榴皮、柑橘皮、火龍果皮、黃皮皮購自海南省海口市鵬泰興超市；供試拮抗菌為實驗室前期分離鑒定得到的2株拮抗菌，分別為JK-A1枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、JK-L1廣島鏈霉菌（Streptomyces hiroshimensis）；真菌基因組 DNA 抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1 000 mL，pH自然；牛肉膏蛋白胨培養基（NA）：蛋白胨 10 g、牛肉膏 3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4；液體NA 培養基不加瓊脂；高氏一號培養基：可溶性淀20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，pH 7.4～7.6；液體高氏一號培養基不加瓊脂。

儀器與設備：BCM－1000生物凈化工作臺，FYL－YS－280L 型恒溫培養箱，NRY－211恒溫培養搖床，AL－204電子天平，ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器，Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L電子顯微鏡，TG16KR臺 式高速冷凍離心機，RV-211M型旋轉蒸發儀，JY300C型電泳儀，GE4832T型PCR基因擴增儀。

1 .2 實驗方法

1.2.1 病原菌分離純化病原菌分離純化采用常規組織分離法[12]。選取自然發病的火龍果果實，用75%酒精消毒后，用無菌水沖洗3次，然后在無菌環境下切取病健交界處組織塊（5 mm × 5 mm），將病健交界處組織塊置于PDA培養基平板上，于 28 ℃恒溫培養箱培養 3～5 d。待長出菌絲后，轉接到新的 PDA 培養 基上繼續恒溫培養, 待長出單菌落后進行單孢培養，直至得到純化的病原菌。

1.2.2 病原菌的柯赫氏法則驗證選取健康、大小、成熟度一致的火龍果，用75%酒精進行表面消毒備用。用無菌打孔器將PDA培養基上培養了3～5 d的新鮮病原菌打成6 mm菌餅。將菌餅貼于消毒備用的 火龍果表面，每個果實接種3個，以接種PDA培養基為對照，置于 28 ℃恒溫箱培養，觀察發病情況。

1.2.3 病原菌形態鑒定將純化菌株接種于PDA培養基，28 ℃恒溫箱培養，待產孢后觀察菌落形態，利用 光學顯微鏡記錄孢子形態和結構，參照《真菌鑒定手冊》[13]進行初步鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定采用 Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取病原菌 DNA，使用真菌鑒定通用引物ITS1 和 ITS4 進行PCR擴增，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，序列測定委托生工生物工程(上海) 股份有限公司完成。將測序結果在 GenBank 核酸數據庫中進行 Blast 比對，并結合數 據庫中的同源序列，利用 MEGA6.0 軟件中的 Neighbor-joining 構建系統進化樹。

1.2.5 拮抗菌的抑菌活性測定通過平板對峙實驗對拮抗菌進行抑菌活性測定，測量抑菌帶寬度，寬度越 大表示抑菌活性越強。

1.2.6 植物提取物的制備植物提取物制備方法參照張新龍[14]的方法，并適當修改。取適量新鮮熱帶水果果皮或主要香辛料（生姜和大蒜），50 ℃烘箱干燥5 h，粉碎機粉碎，過40目篩，稱取25 g干燥植物材料粉末于三角瓶中，按料液比1∶20（g·mL-1）往瓶中加入濃度為95%的乙醇溶液，50 ℃條件下超聲波提取30 min。處理液用4層紗布過濾，以5 000 r·min-1轉速離心20 min。取上清液，50 ℃旋轉蒸發去除乙醇成浸膏狀態，干燥后加入適量蒸餾水超聲振蕩溶解，定容至50 mL，得提取物懸浮母液，于4 ℃冰箱保存備 用。

1.2.7 植物提取物的抑菌效果采用打孔法[15]測定不同植物（香蕉皮、石榴皮、柑橘皮、火龍果皮、黃皮皮、生姜和大蒜）提取液的抑菌效果。采用對倍稀釋法測定植物提取物的最低抑菌濃度（MIC）。菌落被完全抑制時的提取液濃度即為最低抑菌濃度。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，抑菌圈越大表示抑菌作用越 強，并選擇該提取液進行下一步的抑菌實驗。

1.2.8 植物提取液與拮抗菌發酵液復合效果篩選按照單因素實驗數據，以拮抗物質對菌絲生長抑制率指標為考查指標，分別研究拮抗菌種類、拮抗菌濃度、黃皮皮提取液濃度和生姜提取液濃度 對2株鐮刀菌的抑菌活性的影響。4個因素分別設計3個水平（表1），利用SPSS軟件生成正交表（表2），并進行實驗獲得菌絲生長抑制率結果。

表1 拮抗菌發酵液與植物提取液復合抑菌正交設計因素水平Tab. 1 Orthogonal design factors of inhibition of pathogens with combinations of antagonistic bacteria fermentation broth and plant extracts

表2 拮抗發酵菌與植物提取液正交組合表Tab. 2 Orthogonal combinations of antagonistic fermentative bacteria and plant extracts

吸取6 mL植物提取液與拮抗菌發酵液等比例混合于三角瓶中，并與54 mL PDA培養基混勻，倒入培養皿中，每皿20 mL。無菌條件下每個平板中央放置1塊6 mm新鮮病原菌菌餅，重復3次，以加入等量無菌水為對照。置于28 ℃恒溫培養箱中培養，培養5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，按如下公式評判抑菌效果。

2 結果與分析

2 .1 火龍果采后病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌形態鑒定結果從自然發病的火龍果果實上分離得到2種主要病原微生物，分別命名為菌株HL-R1和HL-I1，經過致病性檢驗實驗后，可造成火龍果發病（圖1-A）。病原菌菌株 HL-R1 在 PDA 培養基上的菌落呈圓形，生長旺盛，氣生絮狀菌絲初期呈白色，后期有橙黃色孢子堆產生（圖1-B）；培養基平板背面顏色初期為白色，后變為黃褐色。經顯微鏡觀察可得菌絲及孢子形態（圖2-A），大型分生孢子鐮刀狀，略微向內彎曲，3～5 個隔膜（圖2-B）。根據病原菌菌落形態和大型分生孢子特征，參考《真菌鑒定手冊》，初步鑒定為鐮刀菌屬。

病原菌菌株HL-I1在PDA 培養基生長初期可形成白色絮狀菌絲, 隨后由菌絲中心轉變為淡紫色, 并產生紫紅色色素(圖1-B)；經顯微鏡觀察可得菌絲及孢子形態（圖2-A）大型分生孢子鐮刀形、多細胞、3～5 隔膜；小型分生孢子卵圓形至橢圓形（圖2-D）。根據病原菌菌落形態和分生孢子特征，參考《真菌鑒定手冊》，初步鑒定為鐮刀菌屬。

圖1 病原菌HL-R1和HL-I1在PDA培養基上的形態B中上圖為正面，下圖為背面。Fig. 1 Morphology of pathogen strains HL-R1 and HL-I1 on PDA mediumThe upper two mediums in B are viewed from the front, and the lower two from the back.

圖2 兩株病原菌菌絲和分生孢子形態(400×)A、B：菌株HL-R1的菌絲和分生孢子形態, C、D：菌株HL-I1的菌絲和分生孢子形態。Fig. 2 Morphology of hyphae and conidia of two pathogens(400×)A and B: Morphology of hyphae and conidia of strain HLR1; C and D: Morphology of hyphae and conidia of strain HL-I1.

2.1.2 分子生物學鑒定結果采用 rDNA-ITS 分子鑒定將分離獲得的病原菌鑒定到種。以分離獲得的病原菌菌株HL-R1、HL-I1的基因組 DNA 為模板，使用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增獲得它們的rDNA-ITS 序列（圖3）。測序結果表明，病原菌菌株HL-R1和HL-I1的序列長度分別為 521 bp和557 bp。將病原菌菌株HL-R1序列在NCBI上進行BLAST比對，結果表明，菌株HL-R1的rDNAITS序列與鐮刀菌屬的木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti，登錄號MH707078)的 ITS序列100% 同源, 而菌株HL-I1的rDNA-ITS 序列則與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum，登錄號MK751702)的同源性為100%，因此將菌株HL-R1鑒定為尖孢鐮刀菌。將測序所得的致病真菌 HL-R1 和 HL-I1 的rDNA-ITS序列構建系統進化樹, 得出火龍果致病菌的遺傳關系 (圖4)。

圖3 火龍果致病病原菌 rDNA-ITS序列的 PCR 擴增結果M：DNA Ladder Mix maker，A：HL-R1 擴增產物，B：HLR1 擴增產物。Fig. 3 The PCR amplification results of the rDNA-ITS sequence of the pathogens isolated from pitaya fruitM: DNA Ladder Mix maker; A: HL-R1 amplification product; B: HL-R1 amplification product.

圖4 病原菌 HL-R1和HL-I1的 ITS 系統發育進化樹Fig. 4 The ITS phylogenetic tree of pathogen strains HL-R1 and HL-I1

2.2 兩株拮抗菌的抑菌活性測定兩株菌株JK-A1、JK-L1在NA培養基上的形態如圖5-A所示。通過平板對峙實驗，發現對HL-R1（木賊鐮刀菌）、HL-I1（尖孢鐮刀菌）的拮抗效果明顯，對木賊鐮刀菌抑菌帶寬度分別為 （11.33±0.37） mm和（12.67 ±0.45） mm；對尖孢鐮刀菌分別為（12.75±0.62） mm和（12.93±0 .43） mm (圖5-B)。

圖5 拮抗菌 JK-A1和JK-L1的菌落形態和對兩株病原菌的抑制效果A上圖為正面，下圖為背面Fig. 5 Colony morphology of antagonistic bacteria JK-A1 and JK-L1 and their inhibitory effects on the two pathogensThe top pictures in A are the front, and the bottom pictures are the back.

2.3 植物提取物的篩選及抑菌活性由表3 可知, 選取的幾種植物提取物中，香蕉皮、石榴皮和柑橘皮提取液對兩株病原菌抑制作用比較低；火龍果皮、黃皮皮、生姜和大蒜提取液均具有較明顯的抑制作用，其中黃皮皮提取液的抑制作用較顯著，對HL-R1（木賊鐮刀菌）抑菌圈直徑達到了（24.67±0.28）mm，對HL-I1（尖孢鐮刀菌）抑菌圈直徑達到了（26.00±0.55）mm。根據最低抑菌濃度（MIC）測定結果（表4），黃皮皮對HL-R1木賊鐮刀菌和HL-I1尖孢鐮刀菌的MIC均達到了62.5 g·L-1，抑菌能力最為突出，生姜則僅僅對木賊鐮刀菌的MIC僅達到62.5 g·L-1。因此，選取黃皮皮和生姜2種提取物進行下一步實驗。

表3 不同植物提取物的抑菌圈直徑Tab. 3 Diameter of pathogen inhibition circle of different plant extracts

表4 四種植物提取物對兩株病原菌的最低抑菌濃度(MIC)測定結果Tab. 4 Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of four plant extracts against two pathogen strains

2.4 植物提取液與拮抗菌發酵液的復合抑菌效果經過前期單因素影響因素的篩選，選取效果最佳的黃皮皮和生姜2種提取液，結合拮抗菌，以復合抑菌組合對菌絲生長抑制率為考察指標，抑菌結果見圖6。由圖6可知，菌株HL-R1和HL-I1在不同處理間均受到了明顯的抑制效果。

圖6 植物提取液與拮抗菌發酵液復合正交處理對2株病原菌的抑制效果Fig. 6 The compound inhibitory effect of the combination of plant extracts and antagonistic antibacterial fermentation broths at the orthogonal design on the two pathogen strains

由表5 可知，在對木賊鐮刀菌的正交實驗中，各因素對菌絲生長抑制率影響強弱的次序為：黃皮皮提取液濃度（C）＞生姜提取液濃度（D）＞拮抗菌發酵液濃度（B）＞拮抗菌種類（A）；在對尖孢鐮刀菌的正交實驗中，各因素對菌絲生長抑制率影響強弱的次序為：D＞A＞C＞B，即生姜提取液濃度＞拮抗菌種類＞黃皮皮提取液濃度＞拮抗菌發酵液濃度。2株病原菌得出的結果并不一致，可能是由于2株病原菌對不同的抑菌物質敏感性不同。

表5 拮抗菌發酵液與植物提取液正交組合對2株病原菌的抑菌效果Tab. 5 Experimental results of orthogonal combinations of antagonistic fermentation bacteria and plant extracts against the two pathogen strains

結果分析表明：抑制木賊鐮刀菌生長的最佳條件為：拮抗菌種類 JK-A1+JK-L1、拮抗菌發酵液濃度1×108CFU·mL-1、黃皮皮提取液濃度 500 g·L-1、；抑制尖孢鐮刀菌生長的最佳條件為：拮抗菌種類 JKA 1、拮抗菌發酵液濃度1×108CFU·mL-1、黃皮皮提取液濃度 500 g·L-1。

3 討 論

在本研究中，通過對火龍果致病病原分離、致病性測定以及形態學和分子生物學鑒定等方法，筆者將海南省海口市火龍果采后病害明確為2株鐮刀菌：木賊鐮刀菌（F. equiseti）和尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)。其中木賊鐮刀菌曾被雷夢英等[16]發現可以引起廣東省廣州市地區火龍果的果柄腐爛病，其是否會影響火龍果可食用部分并沒有明確，而林珊宇等[17]在廣西地區也分離得到了木賊鐮刀菌，可造成火龍果的軟腐病。因此，木賊鐮刀菌已經成為危害火龍果采后品質的一種重要鐮刀菌，并且在其他國家或地區已報道該菌可以引起菠蘿、西瓜、花卉等植物的病害[18-20]。據報道尖孢鐮刀菌為上海地區火龍果采后病害的主要致病菌[21]，國內外已報道的被尖孢鐮刀菌嚴重為害的作物還有香蕉、番茄、黃瓜、哈密瓜、西瓜等多種果蔬作物[22-23]。

利用生物抑菌保鮮技術防控植物病害是近年來一種非常有前景的手段，得到了人們的廣泛認可[24]，其中枯草芽孢桿菌作為一種常見的芽孢桿菌屬菌株，具有較強的抑菌活性。如曹琦琦等[25]發現1株對水稻紋枯病菌具有較強拮抗活性的枯草芽胞桿菌，談泰猛等[26]也發現枯草芽孢桿菌可以用來防治辣椒疫病。鏈霉菌屬雖然不如芽孢桿菌屬應用廣泛，但是也有相關抑菌報道。玫瑰輪絲鏈霉菌可以用來防治水稻白葉枯病菌[27]，亞黃鏈霉菌可以用來防治煙草青枯菌[28]。另外在筆者篩選的幾種天然植物混合提取物中，黃皮皮提取物和生姜提取物的抑菌活性最佳，對2株病原菌的抑菌圈直徑均達到了22.35 mm以上。李奕星等[29]研究發現，黃皮不同部位提取物的抗氧化活性強弱關系為果皮＞枝條＞果肉＞枝子，同時趙豐麗[30]研究發現黃皮葉乙醇提取物對黑曲霉、瘡痂病、砂皮病、炭疽病、青霉和芒果蒂腐病等6種植物病原菌具有較強的抑菌作用，其抑菌范圍較廣，而生姜作為一種常見的香辛料，抑菌活性已經被廣泛研究和應用[31-32]。

綜合以上篩選出的幾種植物提取物和拮抗菌，筆者為了探究其復合抑菌效果，考慮了幾種單因素的影響，進行了相應的正交實驗。結果表明，拮抗菌發酵液與植物提取液的復合配比組合對木賊鐮刀菌的菌絲生長抑制率最高達到59.19%，對尖孢鐮刀菌的菌絲生長抑制率最高達到53.11%。本實驗結果表明，拮抗菌可以和提取物復合使用，從而達到更加穩定的抑菌效果，但其復合作用的機制以及在實際應用中的防治效果的高效性和穩定性還需要進一步探索。