真菌細胞自噬的研究進展

段靈濤，祝一鳴，何九卿，舒燦偉，周而勛

（華南農業大學 植物保護學院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣州 510642）

自噬（autophagy）是真核生物中一個高度保守的過程，能夠形成具有雙層膜結構的自噬小體，將一些受損或老化的蛋白質或細胞器包裹起來，運送到溶酶體（動物）或者液泡（植物和真菌）之中進行物質降解和循環，維持或恢復真核生物體內的動態平衡。從1997年YOSHINORI鑒定出第一個自噬基因Atg1以來[1]，在酵母菌和其他一些真菌中共鑒定出了42個自噬基因[2]。根據將底物運送到降解細胞器方式的不同，自噬被分為巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和伴侶介導的自噬（Pexophagy）[3]。巨自噬是一個非選擇性過程，是自噬的主要途徑，本文中的自噬主要指的是巨自噬。自噬將細胞內無用或者破損的細胞器及一些其他底物降解至氨基酸和核苷酸等一些基礎營養物質，并供給機體再次使用，以此維持有機體細胞內的穩態[4]，這對有機體的生存及生長發育是必須的。最近幾十年來，通過對植物病原真菌自噬的研究，發現自噬對真菌的致病性具有重要作用，了解植物病原真菌自噬的過程與致病分子機制，將有助于農業生產中對病原真菌引起的植物病害進行有效防控[5]。筆者介紹了真菌細胞自噬的分子及調控機制以及自噬基因在絲狀真菌中的功能的研究進展，為相關研究提供參考。

1 真菌細胞自噬的分子機制

1.1 真菌細胞自噬誘導的調控一些自噬調節因子會在細胞受到外界生理和環境應激時對自噬進行調控，關于真菌自噬調控的研究才剛剛起步，還不夠深入，目前主要集中于TOR（Target of Rapamycin，雷帕霉素靶標蛋白）途徑上。TOR激酶是細胞適應生理和環境脅迫、調控細胞生長和自噬水平的關鍵因子[6]，是自噬的負調節因子。在細胞受到饑餓、傷害、活性氧積累等逆境刺激時，胞內的信號傳導機制會影響包括TOR激酶及其靶標識別輔助因子RAPTOP（Regulatory-Associated Protein of TOR，雷帕霉素靶標TOR結合蛋白）、蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）、SNF-1激酶等蛋白激酶的活性，進而通過這些激酶控制自噬過程中關鍵的Atg1/Atg13激酶復合體；在稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）中，正常條件下，由于TOR激酶的影響，Atg1處于去磷酸化，Atg13處于磷酸化的狀態下，導致Atg1-Atg13-Atg17復合物各組分間不能結合，處于分離狀態；但在外界饑餓、傷害、脅迫等刺激條件下，上游TOR激酶的活性因受到雷帕霉素的影響而受到抑制，引起Atg1的磷酸化和Atg13的去磷酸化，使復合物各組分結合，形成Atg1-Atg13-Atg17復合物，并定位于PAS位點（Pre-Autophagosomal Structure，自噬前結構），誘導自噬的發生。此外，有研究發現，白介素IL-17與真菌細胞結合后，也會抑制TOR激酶的活性，進而促進自噬，在此過程中抑制TOR的LPF18基因表達升高[7]。作為調控自噬的關鍵因子，TOR激酶感知外界刺激信號的機制目前尚不明確，尚待深入研究。在酵母菌中，PKA也可以通過影響Atg1和Atg13的磷酸化來調控自噬，而且PKA途徑對于自噬的調控是獨立于TOR途徑之外的，在PKA活性降低時能夠引起Atg13的磷酸化和Atg1的去磷酸化，從而促進Atg1/Atg13激酶復合體的形成，誘導自噬[8]。此外，AMPK通過磷酸化A tg13也同樣可以抑制自噬[9]。綜上所述，Atg13的磷酸化在自噬調控方面起著極其重要的作用。

1 .2 真菌細胞自噬小體的形成

1.2.1 Atg1-Atg13-Atg17復合體在真菌細胞自噬發生的最初階段，Atg1-Atg13-Atg17復合體會在臨近液泡的PAS位點招募一些自噬小體形成相關蛋白，絲狀真菌細胞中自噬過程見文獻[10]。Atg1-Atg13-Atg17復合體由絲/蘇氨酸蛋白激酶Atg1、調控亞基Atg13、支架蛋白Atg17與Atg29、Atg31組成，其中在真核生物中高度保守的蛋白激酶Atg1是該復合體的核心，在誘導自噬發生中起到了關鍵作用。Atg13則是復合體的調控亞基，其磷酸化水平負向調節Atg1激酶的活性，Atg13主要由其N端的Horma結構域和C端的無序結構域組成，處于N端的Horma結構域在與Atg9的結合[11]以及募集Atg14方面具有重要作用，并且該結構域內的突變也會影響由氨基酸缺乏引起的自噬[12]；而處于C端的無序結構域則包含著Atg1與Atg17的結合位點，這兩個結合位點對于自噬發生的初始步驟必不可少[13]，同時，Atg13通過與Atg1的結合，能夠穩定Atg1蛋白激酶并增強其活性[14]。而對于支架蛋白Atg17來說，其主要是通過與Atg29和Atg31以2∶2∶2的比例形成1個異六聚體復合物來產生功效，2個高度螺旋的Atg17在其C端聚合，形成1個彎月形的結構，而2個Atg29-Atg31球型蛋白通過相互作用則錨定在該彎月形結構的凹面，形成異六聚體，Atg17通過此結構與Atg29-Atg31相連接保證了自身與含有Atg9的囊泡相似的曲率[15]，有研究指出，Atg17-Atg31-Atg29復合體在自噬中可以介導早期囊泡的錨定[13]。Atg1-Atg13-Atg17復合體作為自噬小體形成過程中的關鍵組分，不僅在自噬反應早期誘導自噬小體形成方面具有重要作用，而且在自噬反應的下游還可以通過與Atg11協同調節自噬小體與液泡的特異性融合[16]。在稻瘟菌中，MoAtg1、MoAtg13和MoAtg17等基因的缺失都會導致致病力的缺失，且敲除MoAtg1基因還會導致產孢量降低、分生孢子脂滴減少、畸形以及附著胞膨壓不足等缺陷[17]。

1.2.2 磷脂酰肌醇3-激酶復合物（PtdIns3K）Atg1-Atg13-Atg17復合體成功組裝后，能夠直接或間接地影響后續多個與自噬小體形成相關的步驟[5]。首先由Atg6、Atg14、Vps15和Vps34所組成的PI3K復合體（Phosphatidylinositol 3-Kinase，磷脂酰肌醇3-激酶）。該復合體分為3類，PI3K復合體Ⅰ包括Vps34、Vps30、Vps15、Atg14和Atg6[18]，其中Vps15是Vps34的調控亞基[19]，Atg14將Atg6和Vps15-Vps34復合物連接到一起，形成復合體，Atg14為復合體Ⅰ所特有，定位于PAS位點和液泡膜，能促進復合體Ⅰ在自噬小體形成過程中行使功能，并能夠介導且復合體Ⅰ定位于PAS位點，參與自噬體囊泡的形成[20]；復合體Ⅱ則包括與復合體Ⅰ相同的Atg6、Vps15、Vps30、Vps34，以及其特有組分Vps38，通過Vps38的介導，復合體Ⅱ定位于內吞作用形成的小囊泡中[20]，參與液泡蛋白分選過程；而Ⅲ類PI3K復合體對自噬則是發揮著最為重要的作用，可以對膜上的PI（Phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）進行磷酸化修飾，產生PI3P（Phosphatidylinositol-3-Phosphate，磷脂酰肌醇-3-磷酸），利用PI3P招募下游蛋白，從而促進自噬體囊泡的形成，但是酵母菌中只含有Ⅰ類PI3K復合體和Ⅱ類PI3K復合體，而與Ⅲ類PI3K復合體相似的Vps34則被Vps15激活后參與了PI3P的形成[21]。此外，有研究指出，在線蟲中Atg6可以通過Atg14和Vps38之間的競爭來調控自噬和內吞作用之間的關系，當內吞作用受到抑制的時候，自噬作用就 會被促進，相似的調控機制在稻瘟菌中也被發現[4,22]。

1.2.3 Atg9介導的膜轉運系統被Atg1-Atg13-Atg17復合體影響的還有Atg9介導的膜轉運系統。Atg9是自噬核心機制中唯一的完整跨膜蛋白，對擬南芥中Atg9蛋白的冷凍電鏡分析發現，Atg9是一個同源三聚體蛋白，其中每個組分都至少包含6個跨膜α螺旋[23]。在酵母菌中，Atg9定位于自噬體膜的外膜，并存在于一些可在PAS與內質網、高爾基體等位點之間穿梭循環小囊泡之中。關于自噬體的膜來源，之前認為主要來自內質網、高爾基體、線粒體和質膜等一些細胞器，通過這些Atg9介導的小囊泡運輸至PAS位點，但最近的研究發現，這些細胞器膜不足以維持后續自噬小體的形成，而絕大多數的自噬體膜是通過自噬小體上結合的Faa1激活FA進入相鄰近的內質網進行磷脂的從頭合成，之后在Atg2-Atg18復合物的介導下整合到擴張的自噬小體上的[24]。Atg9可以與Atg1-Atg13-Atg17復合體中Atg13的N端Horma結構域在PAS位點結合[11]，支架蛋白Atg17能夠特異性識別Atg9，從而將Atg1復合體靶向自噬體膜上[25]。同時，Atg9還是Atg1激酶的直接靶點，通過磷酸化，Atg9可將Atg8和Atg18分別招募至自噬小體形成位點和隨后自噬體的杯狀膜擴張位點，促進自噬小體的形成[26]。另外，在Atg9這個自噬體膜轉運系統中，還有2個關鍵的保守蛋白Atg2和Atg18，其中Atg2是1個外周膜蛋白，通過與PI3P和Atg9在PAS位點結合參與自噬體囊泡的形成[27]；Atg18是1個磷脂酰肌醇結合蛋白，能夠與PI3P直接結合定位于PAS位點，同時也存在于內體和液泡之中，當Atg9與Atg2之間產生相互作用的時候，會引起構象變化，與PI3P一起促進對Atg18的招募[28]。Atg18和Atg2可以形成復合體，在酵母菌中，該 復合體可以調節自噬過程中PAS位點內Atg9的循環[29]。

1.2.4 Atg8和Atg12介導的泛素樣結合系統泛素樣蛋白Atg8是自噬機制中最核心的蛋白，其通過一種類似泛素化的共軛連接方式與PE（Phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺）相連，修飾自噬體膜[30]。在Atg8-PE的形成過程中，首先需要半胱氨酸蛋白酶Atg4對Atg8前體進行處理，在Atg8核心位置中有1個β折疊，該結構域中有1個突出的短的羧基末端，其末端包含1個對Atg8功能重要的甘氨酸，在Atg4的處理下，該殘基被暴露出來，從而形成成熟的Atg8。成熟后的Atg8隨后在依賴ATP的E1活化酶Atg7的作用下被激活，在硫化脂鍵的作用下，Atg8與Atg7中保守的半胱氨酸結合。爾后Atg8又在酯交換作用下從Atg7上被交換到E2連接酶Atg3之上，形成Atg8-Atg3結合物[5]。Atg8與PE相連接的最后一步，則需要1個特異的，由自噬系統中另外一個泛素樣蛋白Atg12介導的E3連接酶復合物的作用[31]。E3連接酶復合物是1個由Atg5、Atg12和Atg16以2∶52∶52的比例形成的六聚體，其形成首先是Atg12在E1活化酶Atg7和特異性E2連接酶Atg10的作用下，與Atg5相連接，形成Atg12-Atg5結合物，隨后該結合物與二聚體Atg16蛋白相連形成1個六聚體，這個六聚體就是Atg8的特異E3連接酶復合物。在這個E3連接酶復合物的指導下，Atg8-Atg3結合物上的Atg8通過脂化作用被轉移到PE上，形成Atg8-PE結合物[32]。Atg8-PE結合物定位于生長中及完整的自噬體膜上，在自噬小體形成、擴張、融合等方面具有重要作用，并且Atg8-PE結合物還可為許多自噬受體和適配器提供一個對接的平臺，在自噬體囊泡的底物選擇方面有很大影響[33]。基于這些功能，Atg8在自噬中起非常重要的作用。在稻瘟菌中，MoAtg8的敲除會破壞通過自噬維持的糖原及脂質的動態平衡，影響無性發育和分生孢子形成，使其喪失致病力[34]。此外，通過對Atg8進行熒光標記的方法來觀察自噬發生位置已成為最常用的手段，也是評估自噬發生和進展的重要標準[35]。

Atg8修飾后的成熟自噬小體，在FYCO（FYVE and coiled-coil domain containing，螺旋卷曲結構域包含蛋白）的幫助下，被系在由ESCRT（Endosomal sorting complex required for transport，內吞分選轉運復合體）機械控制的微管網絡上[36]，運輸至液泡。隨后自噬體囊泡膜與液泡膜通過V-SNARE-type機制進行半融合[32]，即含有雙層膜結構的自噬體囊泡，其外膜與液泡膜融合，而內膜則包裹著底物進入液泡，隨底物一 同被液泡內的酸性水解酶降解。

2 自噬在絲狀真菌中的生物學功能

2.1 自噬在絲狀真菌生長發育中的功能絲狀真菌是植物病原物中非常重要和最大的一個類群，在農業、醫學以及基礎生物學研究等方面具有重要作用。自噬在絲狀真菌生長發育過程中的菌絲發育、產孢繁殖、孢子萌發以及營養代謝等方面起極其重要的作用[37]，通過對稻瘟菌相關自噬基因的敲除發現，當MoAtg8被敲除之后，會對稻瘟菌中通過自噬來維持的糖原代謝平衡產生很大的影響，對其無性發育和分生孢子產生抑制效果，但是這種抑制會在外界葡萄糖和蔗糖的補充作用下得到緩解。在MoAtg4缺失突變體中，稻瘟菌的氣生菌絲減少，子囊和子囊孢子分化延遲，產孢量下降[38]。稻瘟菌中MoAtg1、MoAtg6和MoAtg14敲除突變體的產孢同樣會受到影響，其中MoAtg14的敲除突變體產生的分生孢子存在缺陷，分生孢子內脂滴減少，菌絲發育也受到抑制[37]。在對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中28個自噬相關基因敲除突變體的分析中，發現除了Atg17基因外，這些自噬基因在調控禾谷鐮刀菌營養生長、氣生菌絲發育、脂質的儲存和利用和有性/無性孢子脂滴的降解方面具有重要作用[39]；與正常非饑餓條件相比，這些自噬基因敲除突變體對于饑餓條件更為敏感，其菌株所存在的缺陷也更加明顯，如在稻鐮狀瓶霉（Harpophora oryzae）的HoAtg5敲除突變體之中，突變體菌株在CM培養基上培養7 d后，其菌絲干重高于野生型和回補菌株，但是在缺氮和缺碳培養基上培養后，突變體卻幾乎觀察不到氣生菌絲[40]。此外，在瓜類炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）中，CoAtg8和CoAtg26的敲除會降低其營養生長速率及產孢量[41,42]；膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）中CgAtg4和CgAtg8的敲除也會降低其菌絲量和產孢量，但生長速率卻無明顯的變化[43-45]；米曲霉（Aspergillus oryzae）中AoAtg1、AoAtg4、AoAtg8和AoAtg15基因的破壞則導致氣生菌絲和分生孢子的形成嚴重缺陷[46-48]。對于絲狀真菌來說，無論是饑餓還是正常條件下，自噬作用在其生長發育、繁殖、體內物質代謝與循環方面均具有重要的作用，當自噬基因被敲除，自噬處于受阻狀態時，絲狀真菌細胞將不能及時利用營養物質來供給其自身，從而導致在生長、發育、繁殖等方面出現缺 陷[49]。

2.2 自噬在絲狀真菌致病性中的功能隨著對絲狀真菌細胞自噬作用研究的逐漸深入，發現自噬不僅對其生長發育具有調控作用，而且對其致病力也同樣具有重要的影響。絲狀真菌作為病原真菌，在侵染寄主植物的過程中，病原真菌通常會形成一些特殊的侵染結構來突破植物在進化過程中形成的角質層等防御機制。稻瘟菌作為絲狀真菌研究的模式真菌，在自噬對其侵染過程以及致病力影響方面的研究較多。稻瘟菌侵染寄主植物的過程中，芽管以及附著胞等結構的形成、附著胞膨壓的積累，其養分均來自分生孢子，分生孢子通過降解胞內營養物質以及細胞器等來為侵染過程提供物質與能量，其中自噬是這個降解過程中不可缺少的一環。在對稻瘟菌中的自噬核心基因敲除研究中發現，16個非選擇性自噬基因敲除突變體的稻瘟菌致病力均有所減弱，甚至喪失[16]。其中MoAtg4和MoAtg8的敲除突變體，孢子萌發延遲，分生孢子內降解被限制，分生孢子不死亡，附著胞的形成以及胞內膨壓的積累過程都受到阻礙[38]。MoAtg14敲除突變體中，糖原和脂質降解存在缺陷，導致附著胞內膨壓積累受阻，喪失致病力[37]。此外在稻瘟菌MoAtg1、MoAtg5、MoAtg9，禾谷鐮刀菌除FgAtg17以外的27個自噬基因敲除突變體[39,50,51]，玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）中的UmAtg1、UmAtg8[52]，瓜類炭疽菌中的CoAtg8和CoAtg26[41,42]，膠孢炭疽菌中CgAtg4[44]和CgAtg8[43]，灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中的BcAtg1[53]和米曲霉中的AoAtg1[46]等絲狀真菌自噬相關的核心基因敲除突變體之中，突變體的孢子萌發均有降低，致病力也隨之減弱甚至消失。Atg8是自噬分子機制中最核心的組分，在許多自噬基因敲除突變體之中，突變體內目的基因的敲除缺陷最終大部分會作用于Atg8之上，在缺失MoAtg14的突變體中，觀察不到被熒光所標記的Atg8向液泡移動的過程，Atg14的敲除最終影響到了Atg8蛋白離開PAS位點；在MoAtg1中也發現與此相同的結果[37]。由此可見，自噬在病原真菌致病力方面具有極其重要的作用，自噬作用的受阻缺失會嚴重影響孢子的細胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD），導致孢子無法將胞內養分用于侵染結構的正常形成，從而使 其無法在寄主植物表面定殖，侵染寄主植物。

2.3 自噬相關基因在不同物種之間具有不同作用自噬相關基因在進化上大都是高度保守的，但是人們在對自噬基因功能的不斷深入研究過程中，發現相同的自噬基因在不同的物種之間，其功能也存在一定的差異，且這種差異不僅存在于動物與植物、真菌等的分類層次上，在一些小的分類層次中也存在這種差異。就絲狀真菌而言，相同的自噬基因在不同的屬之間，可能具有不同的作用，如稻瘟菌中6個選擇性自噬基因Atg11，Atg24，Atg26，Atg27，Atg28，Atg29敲除突變體中，菌株的致病力沒有改變[16]，但是在禾谷鐮刀菌中這些基因的敲除突變體卻表現出明顯的致病力下降[39]，在瓜類炭疽菌中，Atg26基因的缺失也會引起菌株的致病力下降。在稻瘟菌中，Atg17的缺失對致病力有影響，而在禾谷鐮刀菌中，對致病力沒有產生明顯的影響[39]。此外，禾谷鐮刀菌中Atg5的缺失會導致菌株營養生長缺陷、菌絲量減少，但是在稻鐮狀瓶霉Atg5敲除突變體中，其菌絲干重卻高于野生型和回補體[40]。在對自噬基因的功能進行分析時，由于自噬基因在不同絲狀真菌中的功能不盡相同，且對病原真菌的致病力有重大影響，因此，對自噬基因在不同病原真菌中的作用及其作用機制等方面，還有待進行更廣泛、更深入的研究。

3 展 望

作為真核生物細胞內重要的物質循環和降解途徑，與自噬相關的研究在過去20多年間取得了非常巨大的進展，自噬的分子機制以及相關基因功能、調控網絡等逐步被人們了解，但是這些研究卻大部分集中于人類、模式動植物以及酵母菌上，在絲狀真菌中的自噬研究也僅局限于子囊菌中，對一些植物病原真菌自噬的了解還不夠全面，甚至是空白的。在對植物病原真菌自噬基因功能的研究過程中，發現一些相同的自噬基因，在不同真菌之間其功能不盡相同，而關于這些區別以及導致這些區別的原因或機制，目前還沒有一個系統的闡述。近年來，隨著細胞自噬研究的逐步深入，人們對自噬的分子機制以及相關基因功能的了解在不斷完善，但在一些細節的了解方面，還不夠全面和深入，如在自噬的調控機制方面，除了TOR，AMPK，PKA等途徑，還有一些轉錄因子對自噬也有非常重要的調控作用[54]，但是關于轉錄因子與自噬蛋白之間的互作機制，目前尚不清楚。此外，與自噬蛋白存在互作的蛋白也在不斷地被發現，例如之前關于Atg8蛋白的互作蛋白，大部分是通過AIM基序與Atg8蛋白產生互作，但是近期發現，在AIM之外還有許多Atg8蛋白的互作蛋白是通過1個UIM基序來與Atg8蛋白進行互作的[55]。這些新的發現不僅極大地豐富了自噬的相關機制，也表明目前關于自噬的研究還處在一個基礎的層面。

今后有待更加廣泛和細致地對不同病原真菌中的自噬機制進行研究。在此過程中，可以考慮通過這些不同真菌之間存在的自噬基因功能差異去尋找一些特定的真菌作用位點，并制定對特定病原真菌引致的特定植物病害的防治策略。