丹酚酸B干預PI3K/AKT通路對STZ誘導大鼠胰島細胞凋亡的影響

袁捷，王肅，姜云生，胡忠慧

（天津市第五中心醫院內分泌科，天津 300450）

胰島β細胞合成和分泌的胰島素是維持人血糖穩態、新陳代謝、生殖、生理所必須的內分泌激素。在糖尿病的發生發展進程中，胰島細胞的功能不斷下降。不管是在糖尿病的發生機制中還是在糖尿病的進展過程中都會發生胰島β細胞的凋亡。研究發現，不論是Ⅰ型糖尿病[1]還是Ⅱ型糖尿病[2]，患者胰腺內的胰島細胞數量都會發生異常的減少。因此，如果能夠有效阻止糖尿病患者胰腺內的胰島細胞的異常凋亡，可延緩糖尿病進程。

丹酚酸B（SalB）是一種從唇形科植物丹參中純化的天然產物，有抗氧化、抗炎、神經保護等[3-4]多種藥理活性。有報道表明，SalB對胰島細胞系的損傷有保護作用[5]，然而其作用機制尚不明確。本研究制備鏈脲佐菌素（STZ）損傷的大鼠胰島團體外模型，考察SalB是否抑制STZ誘導的胰島凋亡，并且進一步探討PI3K/Akt通路在這一現象中的可能機制，為進一步將SalB開發為治療糖尿病的藥物提供基礎研究的數據。

1 實驗材料及方法

1.1 儀器 NU-4750E二氧化碳培養箱（美國NUAIRE公司）；TG16-WS/TG16WS臺式高速離心機（中國湘儀集團）；Nikon Eclipse E600倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad Laboratories公司）。

1.2 藥品與試劑 鏈尿佐菌素（STZ，Lot：WXBC2044V）、膠原酶 V（Lot No.SLBL6045V）購自 Sigma公司；熒光素二乙酸鹽（FDA，Lot No.1028A025）活細胞染料、碘化丙錠（PI，Lot No.326C047）購自北京索萊寶科技有 限 公 司 ；TUNEL 凋 亡 檢 測 試 劑 盒（Cat.NO：KGA7062，Lot：20171102）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，Rat/Mouse Insulin ELISA試劑盒（96 test，Lot No.2707840）購自EMD Millipore 公司，兔抗大鼠 PI3Kβ 抗體（Lot：AG0933936），購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗Akt抗體和兔抗Phospho-Akt（Ser473）抗體（Lot#2854035）購自 Cell Signaling Technology公司；小鼠抗大鼠mouse anti β-actin mAb 抗體（17AV0409）、horseradish peroxidase（HRP）標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，0.45 μm），購自羅氏公司；RPMI-1640培養基（Lot No：ABA211779）、Histopaque 1077（Lot：RNBD9297），均購自Hyclone公司；青霉素鏈霉素（Pen/Strep 100×，Lot No.510210101100）購自 GENVIEW公司；TBD 優級胎牛血清（FBS，Lot：QW20171105-0372）購自天津市灝洋公司；Clarity Western ECL Substrate化學發光試劑盒（Control 102030903）購自BioRad公司。

1.3 動物健康 雄性SD大鼠（清潔級），體質量180～220 g，由天津醫科大學實驗動物中心提供。自然光照，自由飲食。適應性喂養1周。

1.4 大鼠胰島團的分離和純化 取體質量范圍為200～230 g的正常SD大鼠（雄性），腹腔注射10%烏拉坦麻醉，打開胸腔，以D-Hank’s緩沖液心臟灌流至肺葉變白，打開腹腔，暴露胰腺找到膽總管，經膽總管內插管并逆行注入預冷的膠原酶V（1 g/L）溶液8 mL，使胰腺充分膨脹后，迅速取出整個胰腺，在37℃水浴中靜止消化15 min，直接振搖后加入含有10%FBS的D-Hank’s緩沖溶液終止消化。離心半徑8 cm，1 000 r/min離心10 min后，棄上清液，加入Histopaque1077溶液5mL混勻，再緩慢加入Histopaque 1077溶液10 mL和D-Hank’s液10 mL，離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心 15 min，吸出 D-Hank’s和Histopaque 1077層面的胰島團用RPMI-1640完全培養基培養（RPMI-1640完全培養基含有10%FBS和 1%P/S）。

1.5 分組和給藥 參考文獻SalB給藥劑量[6]，體外培養的胰島團分為5組：空白對照組（Control），STZ處理組，STZ+SalB 低劑量（15 μmol/L）組，STZ+SalB中劑量（30 μmol/L）組，STZ+SalB 高劑量（60 μmol/L）組。空白對照組的細胞以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液處理；STZ處理組以8 μmol/L的STZ處理4 h之后換成普通完全培養基；STZ+SalB各劑量組先以STZ處理4 h，換掉STZ溶液，以不同濃度的SalB繼續培養72 h。

1.6 熒光二乙脂/碘丙啶（FDA/PI）雙染檢測胰島細胞活力 SD大鼠胰島團分別用低、中、高劑量SalB處理 72 h，各劑量濃度分別為 15、30、60 μmol/L，通過熒光二乙脂/碘丙啶（FDA/PI）雙染檢測SalB對胰島活性的影響，在熒光顯微鏡下用490 nm激發光濾光片檢測綠色的FDA熒光（活細胞），用510 nm激發光濾光片后檢測紅色的PI熒光（死細胞）。以冷CCD成像系統采集圖像。

1.7 胰島素水平檢測 各組胰島團處理72 h后取上清液，用ELISA法測定，測定方法根據ELISA試劑盒說明書操作。

1.8 TUNEL法檢測胰島細胞凋亡 各組胰島團于包埋盒中以OCT包埋劑包埋，置入-80℃冰箱中速凍。冰凍切片機切片，切片厚度為10 μm。取冰凍切片TUNEL法進行染色。冰凍切片以4%多聚甲醛固定30 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次后，3%BSA+0.3%Triton X-100 于室溫下固定、透明 1 h，根據TUNEL試劑盒說明書操作，圖片用Image J軟件分析處理。每張圖片在高倍鏡下取一定視野，計算胰島細胞凋亡率（胰島細胞凋亡率=胰島細胞凋亡數/胰島細胞總數×100%）。記錄切片大鼠胰島團的凋亡率。

1.9 蛋白質免疫印跡法（Western blot）蛋白分析 以RIPA（50 mmol/L Tris（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS） 于 4 ℃裂解胰島30 min，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清蛋白將其分裝后儲存于-80℃冰箱中保存。BCA法測定蛋白濃度，樣品蛋白按比例稀釋后加蛋白上樣緩沖液（5×）于干式恒溫加熱器上100℃變性10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳。濃縮膠用60 V電壓電泳1 h，將電壓調到110 V電泳2 h后濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，一抗4℃孵育過夜。次日以TBST洗3次后，以HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后加上ECL發光液于BioRad凝膠成像儀曝光獲得蛋白印記。

1.10 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，數據均以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SalB降低STZ誘導的胰島細胞凋亡率 大鼠胰島團以 STZ（8 mmol/L）處理 4 h，換掉 STZ溶液，以不同濃度的SalB（15、30、60μmol/L）處理 72 h。TUNEL凋亡染色法檢測SalB對STZ誘導的胰島凋亡的保護作用。如圖1A所示，DAPI（藍色）標記胰島團的細胞核，TUNEL（紅色）標記凋亡的細胞核。對染色結果進行定量分析，與空白對照組（Control）比較，STZ 處理的胰島團凋亡率顯著上升（12.96±1.53%vs.5.12±0.63%，P＜0.01）。見圖 1B。與 STZ 處理組比較，STZ+SalB中劑量組和高劑量組顯著降低STZ誘導的胰島細胞凋亡（9.44±0.92%vs.12.96±1.53%，7.7±0.91%vs.12.96±1.53%，P＜0.01。見圖 1B。

圖1 大鼠胰島團TUNEL凋亡染色Fig.1 TUNEL apoptotic staining on rat islets

2.2 SalB對正常胰島無損傷作用 為了驗證SalB是否對正常的胰島細胞有損傷作用，以不同SalB濃度（15、30、60 μmol/L）處理大鼠胰島團72 h。SalB 處理過的胰島團以FDA/PI雙染，FDA（綠色）染色活細胞，PI（紅色）染色凋亡細胞。與空白對照組（Control）比較，各劑量SalB組的胰島細胞存活率無統計學差異（P＞0.05），表明 SalB（15～60 μmol/L）對大鼠胰島細胞無損傷作用。見圖2。

圖2 大鼠胰島團FDA/PI染色Fig.2 FDA/PI staining on rat islets

2.3 SalB對胰島素分泌的促進作用 以不同SalB濃度 （15、30、60 μmol/L） 處理大鼠胰島團 72 h，ELISA法檢測胰島團上清液中的胰島素水平。與空白對照組（Control）比較，STZ處理組胰島團上清液胰島素水平顯著降低（P＜0.01）。與STZ處理組比較，30、60 μmol/L SalB組的胰島團上清液胰島素水平顯著升高（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 ELISA法檢測大鼠胰島團的胰島素釋放水平Fig.3 Insulin levels in supernatant of root islets tested by ELISA

2.4 SalB對PI3K/Akt通路的調控作用 與空白對照組（Control）比較，STZ 處理組 PI3K、Akt和 p-Akt水平顯著下降（P＜0.01）。與STZ處理組比較，SalB（30 μmol/L）組 PI3K 水平升高（P＜0.05），Akt水平無顯著變化（P＞0.05），p-Akt水平顯著升高（P＜0.05）；SalB（60 μmol/L）組 PI3K 水平升高（P＜0.01），Akt水平無顯著變化（P＞0.05），p-Akt水平顯著升高（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 丹酚酸B對大鼠PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的作用Fig.4 Effect of Salvianolic acid B on the expression of rat PI3K，Akt and p-Akt proteins

3 討論

SalB有多種藥理學活性，對血糖波動的糖尿病大鼠胰島有保護作用[7]，并且可以改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗[8]。最近的研究表明，SalB對高糖誘導的INS-1細胞凋亡有保護作用[5，9]。INS-1細胞是一種大鼠胰島β細胞系，可用作檢測胰島素分泌。SalB對間歇性高糖誘導的INS-1細胞凋亡有抑制作用，并且提高葡萄糖刺激的INS-1細胞胰島素釋放。無論是Ⅰ型糖尿病還是Ⅱ型糖尿病，共同的病理改變是胰島β細胞的凋亡和逐漸缺失。基于SalB抑制INS-1細胞凋亡的報道，本研究直接提取、純化大鼠胰島團，以STZ處理制備體外的胰島團損傷模型，并以不同濃度的SalB處理研究其對胰島團的整體作用。實驗結果表明，SalB在一定濃度（30、60 μmol/L）下對STZ損傷的大鼠胰島團有保護作用，主要表現為胰島細胞凋亡率的下降。值得關注的是，30和60 μmol/L的SalB直接處理胰島團，對胰島團無損傷作用，表明SalB有胰島保護作用的同時對胰島細胞沒有傷害。此外，兩種濃度的SalB對胰島團分泌胰島素的能力有促進作用。

Huang M等[10]研究了SalB對高脂飲食聯合STZ注射制備的Ⅱ型糖尿病大鼠模型的影響。與模型組比較，口服SalB（100和200 mg/kg）顯著降低血糖并增加胰島素敏感性指數，然而SalB卻降低了Ⅱ型糖尿病大鼠的胰島素水平。而Raoufi S等[11]的研究中，研究者制備了多次低劑量STZ注射的糖尿病大鼠模型。與模型組比較，腹腔注射SalB（40 mg/kg）可以降低糖尿病大鼠血糖水平之外還可以提高血清胰島素水平，與Huang M等的研究在SalB對胰島素水平的結論上相反。本研究中，提取純化了大鼠的胰島團進行體外培養，以STZ處理制備胰島團損傷模型，再以不同濃度的SalB處理胰島團，觀察其對胰島團凋亡、胰島素分泌的效應。實驗結果表明，SalB對大鼠體外培養的胰島團的胰島素分泌水平有促進作用，與Raoufi S等的結論一致。此外，與在體內模型的研究比較，本研究基于離體培養的胰島團，便于探索對SalB對胰島抗凋亡作用的機制。

PIK3/Akt信號通路參與調控細胞的凋亡過程。該通路的激活促進下游cIAP-2和XIAP的轉錄，參與Caspase介導的細胞凋亡過程。cIAP-2和XIAP是Caspase的抑制劑，因此PIK3/Akt通路的激活可以有效抑制凋亡程序[12]。本研究發現，STZ損傷的大鼠胰島團在凋亡水平升高的同時，PI3K、Akt和p-Akt水平下降。與STZ處理組比較，中劑量和高劑量SalB升高PI3K和p-Akt的水平，表明SalB在一定濃度范圍內可以上調PI3K和p-Akt的水平激活PI3K/Akt通路。然而，SalB對Akt的水平沒有影響，表明SalB對PI3K/Akt通路的上調并不通過直接升高Akt蛋白的水平來實現。

綜上所述，SalB促進Akt磷酸化水平激活PIK3/Akt信號通路，從而抑制大鼠胰島團細胞凋亡。SalB的制備工藝成熟，是一種有潛力治療糖尿病的化合物。