毛花獼猴桃花芽石蠟切片制作方法的改良

廖光聯 劉青 鐘敏 徐小彪

(江西農業大學獼猴桃研究所，江西 南昌 330045)

獼猴桃隸屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，是觀賞與食用兼備的多年生落葉藤本果樹，也是20世紀野生果樹人工馴化栽培最有成就的4大果樹之一[1]。獼猴桃果實營養密度較高，富含大量的蛋白質、糖和氨基酸等多種有機物以及人體所必需的多種維生素及礦物質[2]，尤其以抗壞血酸的含量極高，遠高于梨、蘋果等，其果實還具有通便、消炎等醫療功效，頗受消費者和生產者關注[3]。目前市場上主要以鮮食為主，也有部分加工成果脯、果酒，均具有獨特的風味，因此深受大眾喜愛。除此之外，獼猴桃花色多樣極具觀賞性，具有較好的觀賞價值[4]。目前，全世界共有獼猴桃屬植物54個種及21個變種[5]，其中毛花獼猴桃(A.eriantha)為中國特有的獼猴桃屬中的一個重要種類，廣泛分布于浙江、福建、江西、湖南、廣西、浙江、廣東和貴州等地，是繼中華獼猴桃(A.chinensis)和美味獼猴桃(A.deliciosa)之后極具開發潛力的特色漿果，野生種質資源十分豐富[6]。

近幾年，江西省贛南地區因黃龍病的原因，已由臍橙的單種類為主的種植模式向多種類果樹的種植模式轉化[7]。其中，獼猴桃是重要的種植種類之一，主要以中華獼猴桃、毛花獼猴桃及軟棗獼猴桃為主。然而，目前贛南地區獼猴桃的種植存在盲目引種、品種混雜、栽培管理措施未能夠因地制宜等現象。其主要原因是同一區域具有不同的氣候，氣候同時嚴重影響植株的花芽形態分化，如果不能準確把握植株的花芽形態分化時間，將對施肥等栽培管理造成極大的困擾[8]。石蠟切片是花芽分化研究中最為常用的一種技術，但傳統的石蠟切片方法并不適用于獼猴桃這種多茸毛的花芽研究，尤其是毛花獼猴桃花芽，其密集的短茸毛[9]，在進行石蠟切片時會嚴重影響其連片效果，無法形成完整的片段，甚至出現斷片、碎片等現象，以至于無法進行后期的展片、脫水、透明、封片等步驟。因此，本研究以毛花獼猴桃花芽為試驗材料，在傳統石蠟切片方法的基礎上，結合毛花獼猴桃花芽多茸毛的特點，通過對固定、滲蠟、脫蠟及包埋等環節進行改良，探索適合毛花獼猴桃花芽石蠟切片制片的方法，以期為進一步研究贛南山區毛花獼猴桃花芽分化研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為江西省贛州市信豐縣江西萇楚果業有限公司獼猴桃種質資源圃內的五年生毛花獼猴桃“贛獼6號”。采集新鮮完整的花芽，立即置于FAA固定液(90mL 50%乙醇加5mL冰醋酸加5mL福爾馬林)中固定48h以上。

1.2 方法

改良后石蠟切片法的整體試驗流程與傳統石蠟切片流程相似，包括固定、整染與脫水、透明與滲蠟、包埋與切片、展片與粘片、脫蠟與染色、封片與顯微鏡觀察。但改良后的石蠟切片方法需要在固定液固定花芽后進行茸毛剔除處理，同時對透明、滲蠟、染色過程進行了改良。

1.2.1 樣品處理

切取其結果枝從基部數起的第5～7腋芽，放入FAA固定液中固定，迅速運回實驗室進行處理，在直筒顯微鏡下利用解剖針剔除其表面的密集茸毛，隨后放入FAA固定液中繼續保存7d。

1.2.2 整染與脫水

將材料從FAA固定液中取出，蒸餾水清洗數次后用愛氏蘇木精整染3～4d后倒去染液，并用蒸餾水輕蕩洗1～2次，隨后置于稀氨水(5%～8%)中12h。取出后按以下步驟進行脫水處理：50%酒精2h→70%酒精過夜→85%酒精2h→95%酒精2h→100%酒精2h→100%酒精2h。

1.2.3 透明與滲蠟

將材料轉入1/2酒精加1/2二甲苯溶液中30min，再轉入純二甲苯中2次，每次2h。取出后按以下步驟進行滲蠟處理：1/2二甲苯加1/2石蠟4h(55℃)→純蠟液過夜(60℃)→純蠟液24h(60℃)。如果放入純二甲苯中液體變渾濁，說明脫水不徹底，應立即將其轉入95%乙醇中重新脫水，直至加入二甲苯時不再渾濁，透明的時間以肉眼觀察樣品變成透明狀態為準。

1.2.4 包埋與切片

在包埋機上操作，除冷臺外其余溫度都不要超過60℃，最好接近但不低于石蠟熔點，提前將包埋機開好，待石蠟熔化后即可開始。包埋好的蠟塊放入4℃冰箱中放置一段時間再切片效果更好。修塊時，將蠟塊按材料的個數分割成數小塊；然后修整有材料的小塊，相對的兩邊需平行，特別是和刀口相切的兩邊一定要平行，材料的邊緣只留1～2mm的空白蠟；再將修好的小蠟塊粘牢在臺木上，以備切片用。切片時將材料夾在切片機上，并調整好切片機，然后手搖切片機將蠟塊切成薄片，并使成為連續的蠟帶，切片厚度為10～12μm。

1.2.5 展片與粘片

將裝好蒸餾水的燒杯放入38℃水浴鍋中加熱，同時將粘片劑也放入水浴鍋加熱。將小毛筆沾水后把所需蠟帶挑入蒸餾水中，切片充分展平后，用涂有一層粘片劑的載玻片將切片撈起。最后將所有粘好的載玻片統一放入40℃的恒溫箱中，干燥2～3d。

1.2.6 脫蠟與染色

將烘干的載玻片放在染色架上，依次進行下列步驟：二甲苯10min→1/2二甲苯加1/2酒精10min→100%酒精10min→95%酒精10min→85%酒精10min→70%酒精10min→50%酒精10min→蒸餾水10min(若溫度過低，則此操作在烘箱內進行且需延長二甲苯中的脫蠟時間)→4%鐵礬15min→自來水流水洗10min→蒸餾水滴注1次→0.5%蘇木精10min→自來水流水洗5min→2%鐵礬分色至適度(鏡檢確定)→自來水流水洗15min至返藍。

1.2.7 脫水與透明

將返藍后的材料經滴注蒸餾水、30%、50%、70%、85%、95%的無水酒精2次，1/2無水酒精加1/2二甲苯、二甲苯2次，各級5～10min，二甲苯滴注后，置二甲苯缸中。

1.2.8 封片與觀察

將透明后的載玻片取出，滴上中性樹膠，緩緩蓋上蓋玻片，然后放置陰涼處晾干，即成永久封片。先在普通顯微鏡下觀察，找出所需的視野，再在OLYMPUS BH-2型顯微鏡下進行攝影。

2 結果與分析

2.1 傳統石蠟切片與改良后石蠟切片方法對比

改良后石蠟切片與傳統石蠟切片相比，主要的區別集中在樣品處理、脫水、透明與滲蠟、包埋與切片及染色方式，見表1。由于毛花獼猴桃花芽上附著茸毛，影響切片效果，在改良后石蠟切片方法中利用解剖針剔除其表面的密集茸毛可以提高蠟片的完整度。同時，延長了樣品在脫水和透明與滲蠟過程中的時間，盡管殘留部分茸毛，也不會導致切片破碎。切片厚度及蘇木精染色的改良也提高了切片的效果。

表1 傳統石蠟切片與改良后石蠟切片方法對比

2.2 不同固定方式對石蠟切片效果的影響

與傳統石蠟切片方法相比，改良后的石蠟切片方法切出完整的組織切片效率更高，不易造成組織錯位、破碎，見圖1。盡管改良后的石蠟切片方法在樣品處理上操作復雜，但其切片效率較高，與蠟貼合較好，在一定程度上降低了破損概率。

圖1 不同樣品處理后切片效果對比

2.3 傳統石蠟切片與改良后石蠟切片方法效果對比

改良后石蠟切片方法組織染色效果均勻，圖片清晰，細胞輪廓明顯，而傳統石蠟切片方法除切片不完整外，由于浸蠟及脫水時間較短，切片中易殘留氣孔，切片效果較差，易導致切片模糊，見圖2。

圖2 傳統石蠟切片與改良后石蠟切片方法效果對比

3 討論

花芽分化一般分為生理分化和形態分化2大階段，生理分化是營養生長轉向生殖生長的質變；形態分化是在生理分化質變起點的基礎上，在內源物質繼續作用下發育構成完整花器，完成從葉芽生長點到花芽的形態建成過程[10]。對不同氣候下獼猴桃花芽分化時間的研究，有助于因地制宜地制定施肥措施，石蠟切片作為主要的研究方法顯得尤為重要。毛花獼猴桃花芽上的茸毛是對花芽的一種保護，如果不對其進行處理，制片過程中，茸毛浸蠟后變得堅硬，易導致切片破損，最終難以獲得理想的石蠟切片效果。改良后的石蠟切片方法在剔除茸毛后，不僅無茸毛影響，而且材料更易滲蠟，與蠟更貼合，從而獲得良好的切片效果。

在剔除茸毛過程中，難免殘留些茸毛，為了降低茸毛的影響，本研究中還對其它過程進行了優化，包括脫水和滲蠟等步驟。最重要的是，延長了脫水的時間，這樣更有利于提高脫水效果，有效避免切片的氣泡產生。此外，在延長滲蠟時間的同時，還提高了滲蠟的溫度，使得材料與蠟更貼合，有效提高了切片完整性。傳統的石蠟切片采用苯胺番紅染色，而苯胺具有高毒性，對人體有害。參考在石榴和杏上石蠟切片方法改良[11,12]的研究后，本研究采用愛氏蘇木精染色，組織輪廓染色清晰，但存在細胞核染色不清晰的現象。

在利用改良的石蠟切片進行制片時，需注意以下方面。

所有的樣品都在通風櫥進行處理，避免中毒；樣品放入FAA固定液后，由于茸毛間張力，茸毛無法打濕，可以先用溫水浸泡花芽，待茸毛濕潤后放入FAA固定液中；剔除茸毛時務必小心，不要破損組織；脫水務必干凈，如果有水，水會與二甲苯反應，液體變渾濁，此時應繼續脫水，直至放入二甲苯中無渾濁產生；包埋后，可放入4℃冰箱2～3d，切片效果更佳；制片時要清洗載玻片和蓋玻片，避免因灰塵造成陰影。